DB34T 1539-2011 禽蛋中沙门氏菌的检测-荧光PCR 法

ICS07.100.30C53DB34安徽省地方标准DB34/T1539—2011禽蛋中沙门氏菌的检测-荧光PCR法TestingforSalmonellainPoultryeggsQualtativepolymerasechainreaction(PCR)method2011-11-15发布2011-12-15实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1539—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心提出。本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。本标准主要起草人：陈戈、张波、汪永信、安虹、刘娟娟、程潇。DB34/T1539—20111禽蛋中沙门氏菌的检测-荧光PCR法1范围本标准规定了禽蛋中沙门氏菌的荧光PCR检测方法。本标准适用于禽蛋及禽蛋制品中沙门氏菌的快速检测。本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/T4789.19食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1CT值PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数。4方法原理本方法是基于TaqMan实时荧光PCR技术，选取沙门氏菌种属特异性的invA基因序列设计引物和两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针。PCR每进行一次循环，PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系，当荧光信号超过所设定的阈值时，荧光信号可被检测出来。通过观察实时PCR扩增曲线，对样品中的沙门氏菌进行快速检测。5设备和材料5.1实时荧光PCR仪。5.2离心机。5.3微量移液器和灭菌吸头（10μL、100μL、200μL、1000μL）。5.4恒温培养箱。5.5恒温水浴锅。DB34/T1539—201125.6天平：感量为0.1g。5.7均质器或乳钵。5.8灭菌三角烧瓶(500mL、250mL)。5.9灭菌吸管（10mL、1mL）。5.10灭菌平皿（90mm×15mm）。5.11灭菌试管（内径16mm，长160mm）。5.12接种棒、镍铬丝。5.13试管架、试管篓。6试剂6.1除另有规定外，水应符合GB/T6682中一级水的规格，且为灭菌双蒸水，试剂为分析纯或生化试剂。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.2TaqDNA聚合酶。6.3dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。6.4DNA提取试剂：DNA提取液（5％chelex100，10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA）加入100mL灭菌蒸馏水中，摇匀；也可使用商业化的DNA提取试剂盒。6.510×PCR缓冲液：200mmol/Ltris-HCl(Ph8.4),200mmol/L氯化钾（KCL），15mmol/L氯化镁（MgCl2）。6.6引物和探针：正向引物：5’-TGCGGTACTGTTAATTACCACGC-3’；反向引物：5’-GGCATCGGCTTCAATCAAGA-3’；探针序列：5’-TGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTC-3’其中探针的5’端标记FAM、3’端标记TAMRA。6.7培养基：缓冲蛋白胨水（BPW）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）。7检测步骤7.1样品的制备、增菌培养7.1.1禽蛋制品应经过前增菌，以无菌操作的方式称取25g样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min-10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。用1mol/L无菌氢氧化钠或盐酸调pH至6.8＋0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8～18h(干蛋品培养18～24h)。轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42±1℃培养18～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18～24h。7.1.2新鲜禽蛋不必经过前增菌，直接进行选择性增菌，以无菌操作的方式称取25g样品放入盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中，以8000r/min-10000r/min均质1min～2min，或置于盛有25mL灭菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min。用1mol/L无菌氢氧化钠或盐酸调pH至6.8±0.2。以无菌操作的方式移取1mL检样均液接种于10mLTTB内，于42±1℃培养18～24h；另取1mL，接种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18～24h。7.2模板DNA的制备DB34/T1539—20113取培养后的增菌液1mL，加到1.5mL无菌离心管中,8000r/min离心5min，吸弃上清；加入50μLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清保存于－20℃备用以待检测。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。7.3实时荧光PCR检测7.3.1反应体系体积为25μL:10×PCR缓冲液2.5μL、引物对（10μmol/L）各1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、荧光探针（5μmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、模板DNA4μL，加水至25μL。7.3.2反应条件:37℃5min，95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光，进行40个循环，4℃保存反应产物（PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整）。7.3.3检测过程中分别设阳性对照、阴性对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子DNA或阳性菌侏DNA，阴性对照为无菌水。8结果及判断8.1质控标准a)阴性对照：无扩增曲线，Ct≥40；b)阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct值应＜30。否则，实验视为无效。8.2结果判定和报告a)Ct值≥40，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出沙门氏菌；b)Ct值≤35,可判定该样品结果为阳性；c)Ct值＞35而＜40，建议样本重做。重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见规范性引用文件中的方法或相关的国际权威微生物经典检验方法做进一步的生化鉴定和报告。9生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。并参见GB19489中的有关规定执行。DB34/T1539—20114AA附录A（规范性附录）检测过程中防止交叉污染的措施A.1抽样和制样过程抽样和制样工具必须清洗干净,经121℃高压灭菌15min～20min。一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。A.2检测过程A.2.1实时荧光PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区（反应混合物配制区）、PCR区、将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单向进行。A.2.2实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。A.2.3各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃、15min高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20～25℃贮存的试剂中，可加入0.225％的叠氮钠.所有试剂应该以大体积配制,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。A.2.5DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。A.2.6前PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反应个各组分。A.2.7实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。A.2.8可使用UNG酶和dNTP系统控制污染。A.2.9应遵循PCR操作的其他要求。_________________________________