DB34T 2776-2016 谷物中10种真菌毒素的测定 液相色谱串联质谱法

ICS67.040C53DB34安徽省地方标准DB34/T2776—2016谷物中10种真菌毒素的测定液相色谱串联质谱法Determinationof10mycotoxinsingrainbyliquidchromatographytandemmassspectrometry文稿版次选择2016-12-30发布2017-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2776—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、农业部农产品质量安全风险评估实验室（合肥）、安徽省畜牧技术推广总站、池州市农产品质量安全监测中心、安徽科立特农药环境科技评价有限公司、繁昌县植保站。本标准起草人：段劲生、高同春、孙明娜、王梅、李瑞、董旭、肖青青、褚玥、许四五、吴爱美、彭卫兵、朱玉杰、杨通。DB34/T2776—20161谷物中10种真菌毒素的测定液相色谱串联质谱法1范围本标准规定了谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等10种真菌毒素（参见附录A和附录D）残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于小麦、大米和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素（DON、15A-DON、3A-DON），黄曲霉素(B1、B2、G1、G2)，伏马毒素(FB1、FB2)和玉米赤霉烯酮(ZEA)残留量的测定。方法的检出限为0.0002～1.0mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样用乙腈+醋酸水溶液提取，经分散吸附剂净化，液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）定性确证和定量检测，外标法定量。4试剂与材料4.1水为GB/T6682规定的二级水。4.2乙腈：色谱纯。4.3乙酸（冰醋酸）：分析纯。4.4氯化钠：分析纯。4.5无水硫酸镁：分析纯。4.6PSA：分析纯，粒径40～60μm。4.7氨水：色谱纯。4.8乙酸铵：色谱纯。4.9甲酸：色谱纯。4.100.22μm微孔过滤膜。4.11真菌毒素标准品（纯度≥95％）。4.12标准储备溶液：DB34/T2776—20162——分别称取10种真菌毒素标准品，用乙腈配制成1000mg/L的上述10种真菌毒素的各自标准储备溶液，于0～4℃下避光保存，有效期3个月。4.13基质混合标准工作溶液：——将10种标准储备液用空白样品基质溶液配制成不同浓度的基质混合标准工作溶液，待用。——基质标准工作液现配现用。4.140.01％氨水溶液：移取0.1mL氨水（4.6）于1000mL水中，混匀。4.152mmol/L乙酸铵+0.1％甲酸溶液：称取0.1542g乙酸铵（4.7）加少量水溶解，再加入1.0mL甲酸（4.8），混匀，定容到1000mL，配成含0.1％甲酸的2mmol/L的乙酸铵溶液，过0.22μm微孔滤膜。5仪器和设备5.1液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.2万分之一分析天平。5.3匀浆仪。5.4超声波清洗器。5.5离心机，转速不低于3000r/min。5.6旋转蒸发仪。5.7氮吹仪。5.8涡旋仪。5.9移液器。6分析步骤6.1试样的制备与贮藏按照GB5491的规定分别将不少于1000g小麦、大米（已脱壳）、玉米籽粒混匀，四分法取样，放入食品加工机粉碎，过20目筛，制成试样，放入试样瓶中密封，做上标记，并置于-20℃条件下保存，待测。6.2提取称取样品21.0g（精确至0.01g），加入含1％乙酸(冰醋酸）的乙腈：水=84:16（V:V）混合溶剂50mL，振荡30min，超声提取10min，加入适量氯化钠，5000r/min离心3min，取上清夜2mL，待净化。6.3净化取2mL上述乙腈提取液于5mL玻璃试管中，加入200mg无水硫酸镁吸附剂，涡动混合1min，静置，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。6.4测定条件6.4.1液相色谱条件a)色谱柱：C18分析柱，150mmL.×2.0mm,I.D.2.2μm；b)流动相：DB34/T2776—20163——A：0.01％氨水溶液；——B：甲醇；——C：含2mmol/L的乙酸铵和0.1％甲酸的水溶液；——D：乙腈；——液相色谱流动相梯度洗脱具体见表1、表2。c)流速：400μL/min；d)柱温：40℃；e)进样量：5μL。表1液相流动相梯度洗脱程序（测DON、15A-DON、3A-DON）时间min流速mL/min流动相A（0.01％氨水溶液）％流动相B（甲醇）％2.00.410904.00.410904.10.490105.00.49010表2液相流动相梯度洗脱程序（测黄曲霉素B1、B2、G1、G2、伏马毒素FB1、FB1、ZEA）时间min流速mL/min流动相C（含2mmol/L的乙酸铵和0.1％甲酸的水）％流动相D（乙腈）％0.50.470303.50.410905.00.410905.10.470306.00.470306.4.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源（ESI），450℃；b)扫描方式：正负离子扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；d)干燥气温度：250℃；e)干燥气流速：20L/min；f)雾化器流速：3.0L/min；g)离子源接口电压：ESI+，+4.5kV；ESI-，-3.5kVh)10种真菌毒素监测离子对、保留时间、碰撞电压及碰撞能量参见附录B。6.5液相色谱-质谱/质谱测定6.5.1定性测定在相同实验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（相对丰度50％，允许±20％偏差；相对丰度20～50％，允许±25％偏差；相对丰度10～20％，允许±30％偏差；相对丰度≤10％，允许±50％偏差）。DB34/T2776—201646.5.2定量测定本方法采用外标校准曲线法单离子定量测定。为了减少基质对定量测定的影响，需用空白样液来制备所使用的一系列基质标准工作溶液，用基质标准工作溶液按浓度由小到大的顺序，分别进样来绘制标准曲线。并且保证所测试样中真菌毒素的响应值均在仪器的线性范围内。混合基质标准溶液的液相色谱质谱/质谱多反应监测（MRM）色谱图参见附录C。6.6平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行测定。6.7空白实验除不称取试样外，均按上述步骤测定。7结果计算7.1标准曲线使用基质标准工作溶液进样，绘制基质标准工作曲线。待测物残留的响应值应在检测方法的线性范围之内。7.2结果计算和表述试样中10种真菌毒素的残留量按公式（1）计算：mVcXii.....................................(1)式中：X——试样中被测组分的残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C——从标准曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样溶液所代表试样的重量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值。8方法准确度和精密度8.1准确度本方法在0.0002mg/kg～1.0mg/kg间添加浓度的回收率在72.5％～108.3％之间。8.2精密度本标准精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，获得重复性和再现性的值是以95％的可信度来计算，本标准方法的精密度数据参见附录D。DB34/T2776—20165AA附录A（资料性附录）10种真菌毒素中英文名称、方法检出限表A.110种真菌毒素中英文名称、方法检出限序号中文名称英文名称分子量检出限（mg/kg）1DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）Deoxynivalenol296.320.001215A-DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）15-Acetyl-deoxynivalenol337.250.00133A-DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）3-Acetyl-deoxynivalenol337.250.0014黄曲霉素B1AflatoxinB1312.270.00025黄曲霉素B2AflatoxinB2314.290.00026黄曲霉素G1AflatoxinG1328.270.00027黄曲霉素G2AflatoxinG2330.290.0018伏马毒素B1FumonsinB1721.830.019伏马毒素B2FumonsinB2705.830.0110玉米赤霉烯酮Zearalenone318.360.005DB34/T2776—20166BB附录B（资料性附录）10种真菌毒素监测离子对、保留时间、碰撞电压及碰撞能量表B.110种真菌毒素监测离子对、保留时间、碰撞电压及碰撞能量序号名称保留时间ESI模式定量离子定性离子碰撞电压1(V)碰撞能量碰撞电压2(V)1DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）1.304-295.20/265.25295.20/265.25;295.20/138.1511;1115;1514;15215A-DON1.783-337.20/229.05337.20/229.05;337.20/150.1517;1715;1526;1733A-DON1.783-337.25/307.30337.25/307.30;337.25/59.2513;1315;2524;194黄曲霉素B11.569+313.20/241.00313.20/241.00;313.20/285.00-26;-26-40;-25-20;-255黄曲霉素B21.367+315.20/259.05315.20/259.05;315.20/287.05-19;-19-30;-25-22;-256黄曲霉素G11.355+329.20/199.95329.20/199.95;329.20/243.00-13;-13-45;-25-16;-217黄曲霉素G21.136+331.25/313.30331.25/313.30;331.25/245.00-13;-13-25;-35-15;-208伏马毒素B10.957+722.50/334.50722.50/334.50;722.50/352.15-24;-24-40;-35-10;-169伏马毒素B21.686+706.50/336.05706.50/336.05;706.50/354.25-22;-22-40;-35-20;-2210玉米赤霉烯酮2.497-317.20/175.00317.20/175.00;317.20/131.1024;2425;3021;14DB34/T2776—20167CC附录C（资料性附录）空白基质10种真菌毒素标准试样多反应监测（MRM）色谱图（50μg/L）空白基质10种真菌毒素标准试样多反应监测（MRM）色谱图（50μg/L）0.500.751.001.251.501.752.000500100015002000250030001:295.20265.25(-)1/DON/1.3021.001.251.501.752.002.252.50050010001500200025003000350040002:337.20150.15(-)1/15A-DON/1.7761.DON2.15A-DON(Deoxynivalenol)(15-Acetyl-deoxynivalenol)1.001.251.501.752.002.252.5002500500075001000012500150003:337.25307.30(-)1/3A-DO