DB34T 3099-2018 动物饲料中氟腺嘌呤残留量的测定 HPLC-MSMS法

ICS 65.020.30B45DB34安徽省地方标准DB34/T3099—2018动物饲料中氟腺嘌呤残留量的测定HPLC-MS/MS法ThedeterminationofFluoroadenineresiduesinanimalfeedHPLC-MS/MSmethod文稿版次选择2018-04-16发布2018-05-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T3099—2018I前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、宣城出入境检验检疫局、安徽省食品药品检验研究院、六安出入境检验检验局、宣城市农产品质量安全监管局、安徽农业大学。本标准主要起草人：苏婷婷、郝向东、王务平、纪文、程浩、黄金华、丁磊、王伟、晏苒、曾明华。DB34/T3099—20181动物饲料中氟腺嘌呤残留量的测定HPLC-MS/MS法1范围本标准规定了动物饲料中氟腺嘌呤残留量的HPLC-MS/MS的测定方法。本标准适用于动物饲料中氟腺嘌呤残留量的检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法原理试样中的氟腺嘌呤残留采用二氯甲烷提取，SPE柱Sep-pakC18固相萃取小柱净化，HPLC-MS/MS测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱级。4.2正己烷：色谱级。4.3甲酸：色谱级。4.4氨水：含量为25％～28％。4.5二氯甲烷。4.60.1％甲酸-甲醇溶液：移取1.0mL甲酸(4.3)，用甲醇(4.1)稀释并定容至1000mL，混匀。4.70.1％甲酸-水溶液：移取1.0mL甲酸(4.3)，用水稀释并定容至1000mL，混匀。4.820％甲醇溶液：20mL甲醇(4.1)与80mL水混匀。4.940％甲醇溶液：40mL甲醇(4.1)与60mL水混匀。4.100.5％氨水-甲醇溶液：移取0.5mL氨水(4.4)，用甲醇(4.1)稀释并定容至100mL，混匀。4.11氮气：纯度≥99.999％。4.12标准品：氟腺嘌呤，纯度≥99.2％。4.13标准储备液(100μg/mL)：称取10mg（精确至0.1mg）标准品(4.12)，用适量甲醇超声溶解，待完全溶解后用甲醇定容至100mL，混匀。﹣20℃以下避光保存，有效期为6个月。4.14标准工作液(1μg/mL)：用甲醇稀释氟腺嘌呤标准储备液至1μg/mL，4℃以下避光保存，有效期为3个月。DB34/T3099—201825仪器和设备5.1液相色谱-串联四级杆质谱仪：配电喷雾离子源(ESI)。5.2分析天平：感量为0.01mg和0.1g。5.3涡旋混合器。5.4离心机：转速≥10000r/min。5.5固相萃取装置。5.6粉碎机。5.7氮吹浓缩仪。5.8旋转蒸发仪。6试样制备与保存6.1制样操作过程中应防止动物饲料样品受到污染或发生残留物含量变化。6.2将动物饲料放入粉碎机(5.6)中粉碎，装袋置于干燥状态下保存，并标明标记。7测定步骤7.1提取称取2g(精确至0.01g)粉碎后饲料样品于50mL离心管中，加入10mL二氯甲烷(4.5)，涡旋混匀后超声提取5min，再以10000r/min离心5min，取全部上清液至50mL鸡心瓶中，在样品残渣中再加入10mL二氯甲烷(4.5)重复提取一次，合并2次提取液于60℃下水浴旋转蒸发至近干，用5mL40％甲醇溶液(4.9)溶解残渣，加入10mL正己烷(4.2)，2000r/min涡旋混匀1min，静置5min，弃去上层正己烷层，留下层清液备用，待净化。7.2净化SPE柱Sep-pakC18分别用5mL甲醇活化，5mL水平衡，取全部备用液过柱，控制流速为1mL/min，再用5mL水和5mL20％甲醇溶液(4.8)以1mL/min速度淋洗柱子，负压抽干，用5mL5％氨水甲醇溶液(4.10)洗脱，收集全部洗脱液。洗脱液于40℃下氮气吹干。残渣用1mL甲醇(4.1)溶解，过0.22μm的有机滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。7.3测定7.3.1液相色谱参考条件液相色谱条件如下：a)色谱柱：LunaC18（2）柱（5μm，150mm×2.00mm）；b)流动相：——流动相A为0.1％甲酸-甲醇溶液；流动相B为0.1％甲酸水溶液；——等度洗脱程序：流动相A：流动相B为80:20（v/v）；c)流速：200μL/min；d)柱温：40℃；DB34/T3099—20183e)进样量：5μL。7.3.2质谱参考条件质谱条件如下：a)离子化模式：电喷雾电离（ESI)，正离子模式；b)扫描方式：多反应监测（MRM)；c)分辨率：单位质量分辨率；d)其他质谱条件参见附录A；e)使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；详细条件参见附录A；f)毛细管电压、雾化气压力、气帘气压力、辅助气流速、碎裂电压（FP）、碰撞气能量（CE）等参数应优化至最优灵敏度，参考条件和定性离子对、定量离子见附录A。7.3.3定量测定取空白样品按照7.1-7.2处理，配制适用浓度的基质匹配标准工作液(4.13)，按浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积-浓度作图，得到基质匹配标准曲线。在上述色谱条件下，氟腺嘌呤参考保留时间为2.2min。其色谱行为见附录B。待测样液中待测分析物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释至相应范围内再进样分析。7.3.4定性确证在相同实验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的标准物质保留时间偏差在±2.5％之内；在试样谱图中所选择的待测物离子对均出现，且相对丰度与标准工作溶液中定性离子的相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围时，则可确定为样品中存在相应的目标化合物。表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50％20％～50％10％～20％≤10％允许的相对偏差±20％±25％±30％±50％8空白试验除不加试样外，均按上述步骤进行。9结果计算见公式（1）。............................................(1)式中：X——试样中氟腺嘌呤的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；M——试样的体积或质量，单位为克（g）；V——样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；CS——从标准曲线得到的待测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）。SCVXMDB34/T3099—2018410定量限和精密度10.1定量限本标准中氟腺嘌呤定量为0.6μg/kg。10.2精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20％。DB34/T3099—20185AA附录A（资料性附录）液相色谱-串联质谱仪器参数参考条件液相色谱-串联质谱仪器参数参考条件如下：a)电喷雾电压：5500V；b)离子化温度：500℃；c)气帘气流速：50.0L/min；d)雾化气流速：50.0L/min；e)辅助气流速：50.0L/min；f)聚焦电压：400V；g)碰撞室射出电压：13V；h)碰撞气：氮气；i)其他质谱分析参数见表A.1。表A.1主要参考质谱参数化合物母离子（m/z）子离子（m/z）保留时间/min去簇电压/V碰撞能量/eV氟腺嘌呤278.0142.9a2.23532106.945a定量离子。注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。DB34/T3099—20186BB附录B（资料性附录）氟腺嘌呤标准物质的多反应监测（MRM）色谱图图B.1278.0-142.9监测离子色谱图图B.2278.0-106.9监测离子色谱图_________________________________