DB34T 2560-2015 窖泥微生物群落结构快速定量测定 PSP-qPCR绝对定量法

ICS01.040.67X60DB34安徽省地方标准DB34/T2560—2015窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR绝对定量法QuicklydetectionmethedtoquantifypitsmudmicrobialcommunitiesPSP-absoluteqPCRmethod文稿版次选择2015-12-30发布2016-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2560—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、哈尔滨工业大学。本标准起草人：何宏魁、周庆伍、李安军、刘国英、余秀娟、汤有宏、葛向阳、张会敏、蒋军、聂加燕。DB34/T2560—20151窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR绝对定量法1范围本标准规定了一种基于门特异性引物测定窖泥微生物群落结构组成的快速定量优化方法。本标准适用于窖泥中微生物群落结构的快速定量检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1门特异性引物phylum-specificprimers，PSP指特异性扩增某个门的所有微生物基因序列所共有且相对于其余门的微生物基因序列所独有的基因序列的引物对，由一条正向引物（5’→3’）和一条反向引物（3’→5’)组成。3.2荧光定量PCRquantitativePCR，qPCR又称real-timePCR，荧光反转录-聚合酶链反应。3.3Ct值cyclethresholdvalue指PCR反应体系中目标DNA浓度达到人为确定的阈值时的PCR循环次数。3.4TA克隆TAClone是一种亚克隆方式，在连接酶存在的情况下，依赖DNA链两端的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的互补作用，将不同DNA链连接。4原理DB34/T2560—20152实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR过程。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，进而根据未知样品的Ct值在标准曲线的位置得到未知样品中目标序列的初始拷贝浓度的方法。采用SAP技术（单碱基差异原则）设计门特异性引物，在引物的3’端为单核苷酸多态性位点，当在引物3’末端倒数第二个碱基引入错配后，若最后一个碱基是强配对碱基，则此种情况下引物仍可以与模板配对并延伸。5试剂和材料5.1本标准中所用的水，除文中提到的ddH2O属于经过两次蒸馏的双蒸水以外，其他实验室用水均指符合GB/T6682中要求的三级水。所述溶液，在未特别注明，均指水溶液。5.2土壤基因组DNA提取试剂盒。5.3胶回收试剂盒。注：胶回收试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。5.4TA克隆试剂盒。注：TA克隆试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。5.5大肠杆菌感受态细胞。注：大肠杆菌感受态细胞是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。5.6PCR试剂盒。5.7qPCR试剂盒。5.8质粒DNA提取试剂盒。5.9细菌16SrDNA扩增引物。注：第4章中所述主要试剂提及几种试剂盒和试剂，由于不同品牌的试剂盒中试剂和操作步骤略有差异，根据各种试剂盒实际使用效果，为方便本标准的使用者，现对部分试剂盒给予常用供应商标注，供标准使用者参考。6仪器和设备6.1紫外核酸检测仪。6.2荧光定量PCR仪。6.3PCR仪。6.4凝胶成像系统。6.5高速冷冻离心机。6.6冰盒。6.7移液枪。6.8八连管离心机。7测定步骤7.1门特异性引物设计DB34/T2560—201537.1.1样品总DNA的提取、细菌16SrDNA的PCR扩增、克隆文库的构建及阳性克隆的筛选提取窖泥样品中的基因组总DNA（按5.2说明书的方法），以此为模板扩增接近全长的16SrDNA。选择扩增引物1，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将指定片段的条带切胶回收纯化（按5.3说明书的方法），然后进行TA克隆（按5.4说明书的方法），连接产物进行转化（按5.5说明书方法），后进行蓝白斑筛选，获得一定数目的有效克隆2。注1：扩增引物可以选择27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），但不限于此。注2：有效克隆在这里指最后的双向测序序列经过序列比对确实属于16SrDNA序列。7.1.2克隆测序、序列分析有效克隆经过DNA测序，得到双向测序序列，利用拼接软件完成双向序列拼接，去掉来自克隆载体的多余序列。经过相应网站（见编制说明）的进行比对，确定与已知序列的同源关系。将结果相同的序列归为一个OTU（Operationaltaxonomicunit）。可进一步通过将各OUT的未知代表序列和已知标准菌的序列一起建立系统发育树的方式确认彼此之间的亲缘关系。把相同的门归在一起，不同的门之间的序列差异通过SAP技术处理3，这些引物对以每个门的实际16S序列的TA克隆纯质粒为模板进行PCR（按4.5说明书的方法）验证及所有门混合模板验证，以及qPCR（按5.6说明书的方法）验证，结果要求只扩增出来特异目的条带，Tm值分析只有主带，且不含引物二聚体或极少二聚体，得到门特异性引物序列4。注3：所述引物在SAP技术处理过程中，在某些引物的3’端倒数第二碱基引入人为错配，该错配不影响靶序列的扩增，却可以破坏非靶序列的扩增，增强了引物的特异性。注4：得到的门特异性引物序列直接通过有关生物技术公司合成。7.2群落结构定量方法-PSP-qPCR绝对定量法注：由于不同qPCR定量测定涉及qPCR体系配制和程序设定，而不同qPCR试剂盒和不同qPCR仪在操作上会有所不同，本标准给出的方法较笼统，具体操作可参考附件C中举例说明。7.2.1普通PCR引物筛选实验a)进行梯度PCR，电泳。通过电泳，选择最佳退火温度，将产生引物二聚体的引物排除。b)选择出来的引物扩增对应门的16SrDNA序列和非对应门的16SrDNA序列。模板选择使用TA克隆质粒。选择能够正确扩增目标序列的引物（选择引物的原则是所选引物能正确扩增目标序列，对非目标序列不扩增。若引物对目标序列正常扩增，对非目标序列有微弱的扩增，对此引物选择保留）。7.2.2qPCR预实验经普通PCR试验筛选出的PSP引物进行qPCR预实验5（按5.7说明书的方法）。检查扩增曲线和溶解曲线。溶解曲线中，只有PCR产物所产生的峰，没有引物二聚体峰存在。同时做空白对照（以ddH2O为模板）和阴性对照6（以非目标质粒为模板），确保没有扩增曲线产生，即一直保持水平线，没有起峰，没有典型的对数生长期。另外，引物二聚体扩增峰典型得出现于空白对照中，尤其是扩增循环的后面几个循环。即这种情况下，实验样品扩增曲线和溶解曲线正常，空白对照的溶解曲线只有引物二聚体的峰,阴性对照只有非目标产物峰或者引物二聚体峰。注5：所述qPCR预实验是指只进行简单的qPCR试验，不需要配合使用标准品制作标准曲线。DB34/T2560—20154注6：如果阴性对照出现了扩增曲线，非目标序列微弱扩增。在qPCR扩增曲线图谱中表现为阴性对照，即非正常扩增的目标产物的扩增曲线开始起峰的循环数少于正常样品的循环数。少于35个循环，选择保留，检测时，只要将qPCR检测程序设定为35个或稍少于35个循环即可。此外，如果发现某检测样品的CT值大于阴性对照，默认该样品的检测目标为0。7.2.3质粒标准品的制备质粒标准品可以是纯化后的PCR产物，也可以是含有PCR产物的质粒。本标准中选用含有PCR产物的质粒。具体制备过程参考附件B。7.2.4qPCR体系的配制7.2.4.1qPCR扩增体系基因组模板（来自于样品中，记为N组）、引物（待测定门的特异性引物）、TaqDNA聚合酶、qPCR缓冲液（含dNTP和Mg2+）、ddH2O（灭菌）、制备好的质粒（用作qPCR标准品）。7.2.4.2质粒标准品的梯度稀释1)准备10个无菌的1.5mL的离心管，每管中加入18μL的双蒸水，吸取质粒原液2μL加入到第1管中，然后用手指弹匀，离心甩下来（转速达到5000rpm立即停止）；再弹匀甩下来，这样每个稀释液弹匀离心两次，得到10-1稀释液。2)再在第一个管子中吸取2μL到第2管中，如前操作，得到10-2稀释液。3)如操作1）、2），计稀释8个梯度，即梯度稀释至10-8。4)然后使用最后6个梯度进行QPCR定量，舍掉10-1和10-2两个梯度。注：稀释的梯度和稀释倍数可根据实际需要而定，不限于以上所述。根据经验，对于微生物门的质粒梯度一般稀释8个梯度，梯度稀释一般选择10倍稀释。最终用来制作标准曲线的稀释点取决于被检测未知样品的浓度范围，最好是保证未知样品的浓度点位于标准曲线的直线范围。7.2.4.3qPCR体系的配制qPCR体系的配制包括标准品和未知样品的配制。其中：——MixⅠ是不含模板的所有qPCR试剂的混合物（包括qPCRbuffer（含荧光物质）、Primers、TaqDNA聚合酶、ddH2O）；——MixⅡ是包含MixⅠ和样品各自模板混合物。a)配制标准品MixⅠ首先计算配制Mix的管数：实验组数：比如说，某试验需要6个梯度稀释的标准品做标准曲线，测一个未知样品的浓度，同时试验中设置一个阴性对照。6组梯度+1组基因组+1NTC（对照）=8组；每组实验3个平行，故计需配制组数N=（8+1）×（3+1）=36管2。所以，配置MixⅠ的时候需要配相当于36管的试验量的MixⅠ。注：为方便具有足够的MixⅠ配置MixⅡ，一般配制多一倍组的所需体积的MixⅠ。多出来的1倍量用于弥补配置MixⅠ粘到管壁上的损失和稍后配置MixⅡ粘在移液枪头上的损失。此处为经验值，因为MixⅡ为一个样品的3次重复实验的实验液的量。DB34/T2560—20155按5.7说明书，配制12μL体系（12μL体系不是不可更改的，可按照试验要求，按照比例更改试验体系的体积为25μL或者50μL），如表1：表1PCR扩增体系ddH2O：3.2μL×36=115.2μLqPCRbuffer（含荧光物质）6.0μL×36=216μLPrimers：1.6μL×36=57.6μLTaq酶：0.2μL×36=7.2μL基因组：单加1μLb)配制标准品MixⅡ准备8个无菌的1.5mL的离心管，用于配制8组反应液。按5.7说明书，配制12μL体系，如表2：表212μLPCR扩增体系MixⅠ：11μL×3.5=38.5μL基因组模板：1μL×3.5=3.5μL注：表1中，配置MixⅠ的时候，三次重复试验的以×4进行计算，而表2中使用MixⅠ配置MixⅡ时，三次重复试验按照×3.5进行计算，以这种方式给与液体转移足够的液体损失空间。等最终上样的时候按照准确的×3进行加样，即每管12μL的加液量。c)八连管分装按表3位置分装：（注：表3所图示为ABI-Stepone48孔qPCR仪器的排布，实际试验中根据所使用的仪器型号可能排布方式不同，只要保证qPCR仪器程序设置的顺序和加样顺序一致即可。）表3八连管分装位点S-10S-10S-10S-9S-9S-9S-8S-8S-8S-7S-7S-7S-6S-6S-6S-5S-5S-5N①N①N①NTCNTCNTCS-10S-10S-10S-9S-9S-9S-8S-8S-8S-7S-7S-7S-6S-6S