人非小细胞肺癌循环肿瘤细胞系的建立及意义

人非小细胞肺癌循环肿瘤细胞系的建立及意义—肺癌转移病因“伏毒”的本质研究罗斌1，阙祖俊2，姚嘉良1，施奇惠3，田建辉1,2*（1.上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科上海200032；2.上海市中医药研究院中医肿瘤研究所上海200032；3.复旦大学上海医学院生物医学研究院上海200032）第一作者：罗斌，硕士，住院医师，主要研究方向：中西医综合防治恶性肿瘤研究；E-mail:[e-mail]；手机：[phone]通讯作者介绍：田建辉，博士生导师，主任医师，主要研究方向：中西医综合防治恶性肿瘤研究。E-mail:[e-mail]基金项目：国家自然科学基金委员会·面上项目（81774166）：从免疫衰老与循环肿瘤细胞揭示肺癌发病及转移核心病机“正虚伏毒”的形成机制；负责人：田建辉。国家自然科学基金委员会·青年项目（81803777）：重楼皂苷诱导循环肿瘤细胞失巢凋亡抑制肺癌转移的作用及机制研究；负责人：阙祖俊。摘要：转移防控效率不高导致肺癌患者死亡率居高不下，由于对远处转移发生的“种子”—循环肿瘤细胞认识不足而不能实施精准干预是重要原因。课题组成功建立首例人非小细胞肺癌循环肿瘤细胞系—CTC-TJH-01，确定了其表型特征和生物学特征，并以此为基础构建肺癌转移研究的特异性研究平台，将提高肺癌转移的转化研究水平，促进肺癌转移防治瓶颈的突破，同时丰富了肺癌核心病机“正虚伏毒”的内涵。关键词：转移肺癌循环肿瘤细胞正虚伏毒据2019年美国癌症治疗与生存统计报告资料显示，非小细胞肺癌Ⅰ期患者的5年相对生存率为57%，而Ⅳ期患者的5年相对生存率仅有4%[1]，提示积极阻断早期肺癌的转移发生是提高患者整体生存率的关键。但目前尚缺乏有效的干预手段[2]，其主要原因是对转移发生的种子—血液和淋巴系统中循环的肿瘤细胞—研究不够深入。而目前针对原发灶病理和分子诊断结果设计的各种干预措施实质上均缺乏精准指导，这是导致目前仍缺乏抗肿瘤转移药物的关键原因[2]。目前大量临床研究发现早期肿瘤患者，其外周血中已经存在循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcells,CTCs）[3]，且CTCs数目与疾病进展和生存预后等相关[4]。课题组研究也发现，早期肺癌患者的外周血中存在较高数目的CTCs，提示需要尽早实施干预[5,6]。Zheng等研究发现高达80%的转移性结直肠癌患者在原发肿瘤长至约10mm3时，就已经向机体的外周循环系统或远处脏器扩散[7]。由于目前临床上最敏感的影像检测工具PET-CT检测下限为2mm，因此肿瘤细胞簇或小于2mm的病灶则无法被发现；而此时的患者体内状态正是复发的萌芽时期，诚如《道德经》所述之“无”的状态，后来发展至临床可以检测出病灶则是“无中生有”的过程。此外，Su等[8]通过对小细胞肺癌患者外周血中的CTCs进行单细胞测序，研究发现CTCs单细胞基因组测序可反应肿瘤组织的基因突变状况，且CTCs、转移灶与复发肿瘤组织中的DNA复制修复通路相关基因频繁发生突变，提示基于外周血中的CTCs基因突变状态进行治疗策略的制定可能对肿瘤转移防治具有一定的作用。故建立CTCs细胞系，研究CTCs的生物学特性和鉴别出真正导致转移发生的CTCs亚群的分子特征，进而基于该亚群的CTCs开发抗肿瘤转移药物，使在外周循环阶段的CTCs发生失巢凋亡或诱导已侵入靶器官的CTCs进入静止期。总之，CTCs细胞系的建立是目前研发抗转移药物的关键环节。一、建立首例人源非小细胞肺癌循环肿瘤细胞系[9]采集非小细胞肺癌患者外周血10ml，通过离心去除富含血小板的血浆，用Hank’s平衡盐溶液（Hank’sbalancedsaltsolution,HBSS）重悬细胞后，加入包被有EpCAM和EGFR的免疫磁珠混合物进行孵育，然后用HBSS进行稀释后，将样品通过鱼骨形芯片，在鱼骨形芯片上放置磁铁用于捕获结合了免疫磁珠的CTCs，冲洗非特异性结合的细胞，然后撤去磁铁，收集CTCs[9]。将捕获得到的CTCs转移至低吸附的96孔板中，并添加RPMI1640培养基（含20ng/mL上皮生长因子EGF，20ng/mL碱性纤维生长因子FGF2，B27添加剂及1%的抗生素）于37℃、5%CO2、3%O2的培养箱中培养，待CTCs开始增殖时转至正常氧气浓度下培养[9]。在尝试对35例NSCLC患者的CTCs进行了分离和体外培养，最终来自于一位II期女性肺腺癌术后患者的CTCs被培养成功，建立了肺癌循环肿瘤细胞系，命名为CTC-TJH-01，单细胞测序发现CTC-TJH-01细胞来自于原发灶[9]。目前已对该细胞系申请了专利。二、NSCLC外周血CTCs细胞系的生物学特性探索1、CTC-TJH-01细胞具有休眠、干细胞表型和免疫逃逸的特性为揭示CTC-TJH-01细胞的生物学特性，课题组将其与原代肺癌细胞A549和95-D细胞进行了比较研究。镜下形态学观测发现CTC-TJH-01细胞核较大、核轮廓不规则、核仁突出、核质比高，细胞大小显著大于95-D和A549细胞。细胞增殖实验研究发现CTC-TJH-01细胞增殖能力较弱，但与95-D和A549细胞相比，对顺铂和泰素帝的耐药性更强[10]。此外，课题组还对CTC-TJH-01、95-D和A549细胞的表型进行了分析，研究发现CTC-TJH-01细胞处于EMT的中间阶段，同时高表达皮型钙黏蛋白（E-cadherin）和神经元型钙黏蛋白（N-cadherin），且具有高代谢、干细胞表型和免疫逃逸特征[10]。Laure等在人结直肠癌循环肿瘤细胞中也观察到了相同的结果[11]。此外，我们还对CTC-TJH-01细胞分泌的细胞因子进行了研究，发现CTC-TJH-01细胞低表达淋巴细胞招募相关趋化因子CX3CL1，高表达转移相关细胞因子CXCL5[10]。而前期大量研究发现高表达CX3CL1的LLC细胞可招募CD8+T淋巴细胞、树突状细胞、NK细胞的浸润，进而发挥抗肿瘤免疫活性，抑制肿瘤生长[12,13]。而临床研究发现CXCL5的表达水平与肺癌患者的无疾病进展生存期和总生存期相关[14]，CXCL5可促进肺癌的增殖和转移[15]。通过肿瘤细胞与淋巴细胞进行共培养实验也证实CTC-TJH-01细胞对T淋巴细胞和NK细胞的招募能力显著弱于95-D和A549细胞；采用siRNA下调CTC-TJH-01细胞上CXCL5蛋白的表达可抑制其侵袭和转移[10]。此外，课题组采用聚甲基丙烯酸羟乙基酯（poly-HEMA）建立了CTC-TJH-01细胞悬浮生长模型，研究发现悬浮培养的CTC-TJH-01细胞具有自身聚集成可逆性的细胞团块，其结构与类器官相似，此外还具有生长抑制、细胞周期阻滞、失巢凋亡抵抗和对化疗药物不敏感等生物学特征。Aceto等[16]研究发现，血液中的CTCs细胞簇是单细胞转移能力的20~50倍，而采用钠-钾ATP酶抑制剂解离CTC细胞簇可抑制其转移[17]，提示CTCs形成细胞簇可能是其抵抗失巢凋亡进而发生转移的机制，表明基于CTC-TJH-01细胞建立的类器官模型可用于抗肿瘤转移药物的筛选。由此，课题组把阻止CTCs聚集成簇和失巢凋亡并列为筛选有效药物的评估指标。2、CTC-TJH-01体内致瘤性和转移能力评估为证实肺癌患者来源的循环肿瘤细胞是否具有致瘤性和肺转移能力，课题组采用模式动物实验方法，将不同免疫背景的小鼠进行CTC-TJH-01移植，发现细胞通过皮下接种到免疫缺陷小鼠体内，研究发现CTC-TJH-01细胞的致瘤率100%；与原代A549细胞相比，CTC-TJH-01细胞的肿瘤生长速度较慢，其结果与体外细胞增殖实验相一致[10]。此外，课题组还采用CTC-TJH-01细胞在NOD/SCID小鼠上建立了皮下移植瘤肺转移模型，发现CTC-TJH-01细胞可以从皮下移植瘤转移到肺[10]。上述研究提示肺癌早期术后患者外周血中已经存在的循环肿瘤细胞具有致瘤性和转移能力，它们可能是导致肺癌复发与转移发生的关键。然而目前这一观点尚未受到足够的重视，导致现有治疗策略对于早期肺癌患者的总生存获益有限。3、NK细胞功能状态与NSCLC外周血CTCs免疫逃逸密切相关为进一步验证CTC-TJH-01细胞是否具有转移能力，采用不同免疫背景的小鼠进行研究，其中包括免疫正常的C57BL/6小鼠，T淋巴细胞缺失的裸小鼠，以及同时缺少T淋巴细胞和NK细胞的NOD/SCID小鼠。然后在相同的实验条件下通过尾静脉注射将CTC-TJH-01细胞接种到小鼠体内，由于小鼠品系及免疫背景不同，导致其肺部成瘤率也存在很大的差异。结果发现CTC-TJH-01细胞在C57BL/6小鼠和裸小鼠的肺部均不成瘤，而在NOD/SCID小鼠上肺部成瘤率100%[18]。提示小鼠外周血中存在的免疫细胞（如NK细胞）对CTC-TJH-01细胞具有较大的排斥作用，而CTC-TJH-01细胞可能以休眠的状态存活于裸小鼠的肺部，但有待进一步验证。然而，Dewan等研究发现将人源乳腺癌细胞与NK细胞共注射接种到NOD/SCID小鼠体内，可显著抑制乳腺癌的生长和转移[19]。而Alexander等研究发现NK细胞可通过释放IFN-γ和TNF-α来诱导肿瘤细胞进入休眠状态[20]。Tobias等也发现NK细胞可通过穿孔素途径诱导CTCs休眠，进而抑制肺癌转移的发生[21]。此外，Taryn等研究发现在转移性乳腺癌患者的外周血中，CTCs数目越多，其NK细胞的杀伤活性越低[22]。而Mao等研究发现基于NK细胞的免疫治疗可减少晚期非小细胞肺癌患者外周血中的CTCs数目[23]。上述研究均提示NK细胞的功能状态与肿瘤的转移密切相关，而基于NK细胞开展免疫治疗可能对预防肺癌转移具有一定的作用。4、建立肺癌转移类人源化小鼠模型基于CTC-TJH-01细胞我们正在构建模拟临床肺癌转移实际过程的小鼠体内研究模型，即通过提取人外周血单核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC），然后将PBMC与CTC-TJH-01细胞混合后通过尾静脉注射接种到NOD/SCID小鼠体内，进而构建可以体现肿瘤所处免疫内环境的类人源化小鼠模型，基于该模型筛选抗肺癌转移的药物。三、CTCs细胞系的建立有助于将肺癌精准治疗的理念落实到早期术后转移防治领域转移是导致90%恶性肿瘤患者死亡的关键因素，目前防治肺癌复发转移的效率亟待提高[24]。其根本原因是缺乏对转移发生的机制的认识和精准干预。目前早期肺癌术后患者的治疗如化疗、生物靶向治疗等均针对原发肿瘤细胞进行干预，而作为远处转移发生种子的循环肿瘤细胞并没有作为靶点。早在1869年澳大利亚科学家ThomasAshworth在一例患者血液中发现CTCs后，近20年来，该领域发展迅速，CTCs在肺癌的早期诊断、预后评估、药物筛选领域都有重要价值[3]，已经和ctDNA、外泌体等一起成为临床液体活检的重要组成部分[25]。因此，建立稳定的循环肿瘤细胞系是突破肺癌转移疗效瓶颈的关键。由于外周血中的CTCs数目极为稀少（每毫升血约含有1~100个CTCs）[26]，导致循环肿瘤细胞在体外建系的难度极大，目前仅有乳腺癌、结直肠癌和小细胞肺癌等少数癌肿建立了循环肿瘤细胞系[11,27,28]。而我们课题组建立了非小细胞肺癌的循环肿瘤细胞系，并初步探索了它发生免疫逃逸和转移的机制。本研究建立稳定的CTC-TJH-01细胞系对促进肺癌转移研究具有重要意义。首先是课题组首次建立了人肺癌外周血中的循环肿瘤细胞系，丰富了肿瘤细胞生物学研究内容。其次从中西医融汇的角度，提出“正虚伏毒”为肺癌转移的核心病机[29]，而CTC-TJH-01细胞的建立及其生物学特征的验证，是对“正虚伏毒”学术观点的有力佐证，实现了从临床科学问题出发—提出科学理论—回归临床应用的科学研究思路；最后，其重要的意义在于为精准医学理念指导早期肺癌术后的转移预防提供了明确靶点，目前课题组正基于CTC-TJH-01细胞筛选抗肿瘤转移的中药小分子化合物