基因工程的载体

三、基因工程的载体三、基因工程的载体（一）载体的功能及特征（二）大肠杆菌载体（三）酵母载体（四）植物载体（五）动物载体（一）载体的功能及特征„载体：将外源DNA携带进入宿主细胞的工具。„载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供条件。载体的分类载体的分类„„依据载体的生物来源分为：依据载体的生物来源分为：病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体„„按照导入的受体生物分为：按照导入的受体生物分为：大肠杆菌载体大肠杆菌载体酵母载体酵母载体植物载体植物载体动物载体动物载体„„根据载体的用途分为：根据载体的用途分为：克隆载体克隆载体表达载体表达载体基因载体必须具备的特征条件：„„对受体细胞的可转移性。对受体细胞的可转移性。„„具有与特定受体细胞相适应的复制位点或具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。整合位点。„„具有多种单一的核酸酶识别位点。具有多种单一的核酸酶识别位点。„„具有合适的选择标记。具有合适的选择标记。„„分子量较小，多拷贝。分子量较小，多拷贝。（二）大肠杆菌载体大肠杆菌载体主要有：大肠杆菌载体主要有：①质粒载体；①质粒载体；②噬菌体载体；②噬菌体载体；③柯斯（粘粒）质粒③柯斯（粘粒）质粒1.1.质粒载体质粒载体„质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA），1-200kb以上。„并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。„自身在细菌细胞中能不断复制繁殖,质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。大肠杆菌质粒分子结构大肠杆菌质粒分子结构（（11）质粒的分类）质粒的分类①根据赋予的宿主的遗传性状分：①根据赋予的宿主的遗传性状分：FF因子（性因子）因子（性因子）RR质粒（抗性因子）质粒（抗性因子）ColCol质粒（产大肠菌素因子）质粒（产大肠菌素因子）②根据质粒的可转移性可分成两大类：接合型质粒：天然条件下自发地进行细胞间接合。非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合。③根据复制控制类型分类根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：„严紧型复制控制的质粒1-3拷贝„松弛型复制控制的质粒10-200拷贝在基因工程中，为提高工程菌表达效率，一般选用松弛型复制控制的质粒。（2）质粒的基本特性„1)自主复制性„2)不相容性„3)可扩增性„4)可转移性„5)携带遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有重要意义。5'3'5'3'质粒DNA的转移和复制（3）质粒DNA的转移1）质粒转移的必备条件ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺式作用（cis-action）ii.细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用2）质粒转移类型ⅰ.自我转移（Self-transmissible）ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。++导入自主转移H++Hdonor无DNA转移H辅助转移H质粒自主转移R+RRRR+Notransfer+HH重组DNA转移R-重组DNA分子质粒的辅助转移质粒的重组转移（4）质粒的命名人工组建的质粒第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一个字符p,用小写。后面有两个字母是大写，代表质粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。天然质粒载体天然质粒载体天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。如（号括起来。如（ColE1ColE1）。）。（5）质粒的构建天然质粒的缺陷分子量大分子量大拷贝数低拷贝数低单一酶切位点少单一酶切位点少遗传标记不理想遗传标记不理想ColE1和pSC101是两类天然质粒的代表，人工构建的质粒大都来自它们。pSC101:第一个用于基因克隆的天然质粒。宿主细菌沙门氏菌，9.1kb，严谨型复制，1-2copy/cell，但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。缺陷：分子量大缺陷：分子量大拷贝数低拷贝数低ColE1:宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制，1000-3000copy/cell。筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞。缺陷：筛选标志不理想缺陷：筛选标志不理想质粒的人工构建（1）选择合适的亲本质粒，缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（2）加入易于检出的选择标记基因（3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）关于质粒安全性的改造（6）根据基因工程的特殊要求加工特殊的基因元件（7）构建过程力求简单构建方法就是重组，拼接。常用的选择性标记Ap(Amp):Ampicillin氨苄青霉素Tc(Tet):Tetracyclin四环素Cm:Chloromycetin氯霉素Kan(Km):Kanamycin卡那霉素Sm(Str):Streptomycin链霉素R(r):Resistance抗性S:Sensistance敏感性Lac:Lactose乳糖操纵子P:Promotor启动子IPTG：异丙基—巯基半乳糖苷（乳糖类似物）X-gal：5’-溴4-氯3-吲哚β-D半乳糖苷(着色剂)常用抗生素的作用方式及抗性机理常用抗生素的作用方式及抗性机理抗生素名称抗生素名称作用方式作用方式抗性机理抗性机理氨苄青霉素氨苄青霉素（（AmpAmp））一种青霉素的衍生物，通过干扰一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞壁合成之末端反应，而杀细菌胞壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。死生长细胞。blabla抗性基因编码的一种周质酶，即抗性基因编码的一种周质酶，即ββ--内内酰胺酶，可特异的切割酰胺酶，可特异的切割ampamp的的ββ--内酰胺内酰胺环，从而失去杀菌效力。环，从而失去杀菌效力。氯霉素氯霉素（（CmCm））一种抑菌剂，通过同核糖体一种抑菌剂，通过同核糖体50S50S亚基的结合作用，干扰细胞蛋白亚基的结合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻止肽键的形成。质的合成，并阻止肽键的形成。catcat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活氯霉素乙酰化而失活卡那霉素卡那霉素（（KanKan））一种杀菌剂，通过同一种杀菌剂，通过同70S70S核糖体核糖体的结合作用，导致的结合作用，导致mRNAmRNA发生错发生错读。读。kankan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移酶，可对可对KanKan进行修饰，从而阻止同核糖体进行修饰，从而阻止同核糖体之间的相互作用。之间的相互作用。链霉素链霉素（（SmSm））一种杀菌剂，通过同核糖体一种杀菌剂，通过同核糖体30S30S亚基之间的结合作用，导致亚基之间的结合作用，导致mRNAmRNA发生错译。发生错译。strstr抗性基因编码一种特异性酶，可对链抗性基因编码一种特异性酶，可对链霉素进行修饰，从而抑制其同核糖体霉素进行修饰，从而抑制其同核糖体30S30S亚基的结合亚基的结合四环素四环素（（TetTet））一种抑菌剂，通过同核糖体一种抑菌剂，通过同核糖体30S30S亚基之间的结合作用，阻止细菌亚基之间的结合作用，阻止细菌蛋白质的合成蛋白质的合成tettet抗性基因编码一种特异性蛋白质，可抗性基因编码一种特异性蛋白质，可对细菌的膜结构进行修饰，从而阻止四对细菌的膜结构进行修饰，从而阻止四环素通过细胞膜从培养基中转运到细胞环素通过细胞膜从培养基中转运到细胞内。内。人工构建的质粒根据其功能及用途分为:基因扩增的质粒：拷贝数达到每个细胞数千测序质粒：高拷贝数、加装测定顺序所必需的序列整合质粒：装有整合促进基因及整合特异序列穿梭质粒：能在两种不同的受体细胞中复制表达质粒：外源基因能在受体细胞内的高效表达探针质粒：筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。（6）常用质粒多拷贝基因克隆扩增质粒，早期非常著名。pBR322：4363bp特性:a)复制子:多拷贝、松弛型b)选择标记:Ampr、Tetrc)筛选形式:抗性插入失活d)单一切点:27个pBR3324363bp对pBR322质粒可利用插入失活法进行重组体的选择。例如用BamHI切割后插入外源DNA片段，形成AmpR、TetS，在如下的抗菌素培养平板上进行检验，即可方便的筛选出重组体DNA（红色标记的菌落）pBR322质粒载体tetr基因的插入失活效应2pBR322pBR322的优点的优点„„具有较小的分子量，具有较小的分子量，4363bp4363bp，可以克隆，可以克隆10kb10kb以下以下的外源的外源DNADNA。。„„含有含有松弛型松弛型质粒质粒ColE1ColE1的的复制起始位点复制起始位点，可在，可在E.coliE.coliHB101HB101和和E.coliE.coliC600C600等受体细胞进行高拷等受体细胞进行高拷贝复制。贝复制。„„具有两种选择标记基因具有两种选择标记基因AmpAmprr和和TetTetrr。。pBR322pBR322的构建的构建过程过程„„复制起始位点：源于复制起始位点：源于ColE1ColE1衍生质粒衍生质粒pMB1pMB1。。„„AmpAmprr基因：源于基因：源于pSF2124pSF2124质粒质粒转座子转座子Tn3Tn3。。„„TetTetrr：源于：源于pSC101pSC101质质粒。粒。pBR322构建谱系pSC1015.8TetrpMB81.8pBR3126.7pMB93.5TetrpSF21247.4Tn3AmprEcoRITn3AmprTetrTetrAprAmprpBR3125.4pBR3224.3EcoRIPstIHpaI严紧松弛松弛融合特点：松弛、抗性转位特点：松弛、Tetr、Ampr缺点：体积大重排去Tn3上的BamHI特点：Tcr、Apr、松削减特点：Tetr、Ampr、松、小pBR322酶切图谱pBR322pBR322衍生质粒衍生质粒pAT153pAT153HaeII①缺失迁移蛋白基因（mob）的作用位点②拷贝数比pBR322高1.53倍pBR322pBR322衍生质粒衍生质粒pBR325pBR325HaeII①带有三个抗性基因，且都具有插入单一失活位点Amp：PstI,PvuI；Cm：EcoRI,PvuII；Tet：BamHI,HindIII,SalI大肠杆菌噬菌体PICmpUC系统美国UniversityofCalifornia的科学家J.Messing和J.Vieria在pBR322的基础上改造而成。有pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19等。①来自pBR322质粒的复制起点②氨苄青霉素的抗性基因③大肠杆菌β-半乳糖酶基因的启动子及其编码的α-肽链基因（lacZ’）④位于lacZ’基因内的一段MCS区段（10个连续的单酶切位点）pUC18/19pUC18/