Lipofectamine-2000转染说明

LipofectamineTM2000CAT.NO.11668-027Size:0.75mlCAT.NO.11668-019Size:1.5ml4℃储存（不要冻存）说明：LipofectaminTM2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。在含有或是不含有血清的培养基中，DNA-LipofectaminTM2000复合物能够直接加给细胞。在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。关于转染的一些重要建议：1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在上有转染步骤，登陆后点击说明。2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与LipofectamineTM2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEMI低血清培养基（Cat:NO.31985-062）（reducedserummedium）稀释LipofectamineTM2000和DNA.3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条件。4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFMII、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和LipofectamineTM2000的相容性。转染步骤（用于DNA）：按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种0.5-2×105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。悬浮细胞：在准备转染混合物时，每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。2.对于每个转染样品，按下面的方法准备：a、在50μl无血清Opti-MEMI低血清培养基中（或是其它无血清培养基）稀释DNA，并轻轻混匀。b、使用前轻轻混匀LipofectamineTM2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM培养基中。室温下静置5分钟。注意：要在30分钟内混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液。c、室温下静置5分钟后，混合LipofectamineTM2000和DNA的稀释液（总体积为100μl）。轻轻混匀并在室温下静置20分钟（溶液混合后可能会看上去浑浊）。注意：混合物在室温下的6个小时内不会失效。3.细胞板的每个孔中加混合液100μl，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。4.检测目的基因的表达情况前，细胞于37℃CO2培养箱中培养18-48小时。此时不需要改变培养基，但4-6小时后也许需要更换.5.对于固定的细胞系：转染24小时后将细胞以1：10（或更高的稀释度）稀释度转移到新鲜的生长培养基中。如果需要的话，在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。对于悬浮的细胞系：转染4小时后，如果需要，加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表达。转染量度标准：在不同的组织培养板中转染细胞时，根据相对的表面积，按比例加入LipofectamineTM2000、细胞、和培养基，具体情况剪下表。在自动、高产率体系中，建议96孔板的转染混合物的体积为50μl。注意:操作时，可以直接将细胞混入转染混合物中进行快速的96孔板转染。在细胞板中准备好转染混合物，然后直接加入说明中正常100μl体积时浓度的2倍浓度细胞培养液。在转染混合液存在情况下，细胞可以正常的贴壁。培养容器每个孔的表面积（cm2）相对于24孔板的表面积铺板培养基体积DNA(μg)/培养基（μl）LipofectamineTM2000（μl）/培养基（μl）96孔板0.30.2100μl0.2μg/25μl0.5μl/25μl24孔板21500μl0.8μg/50μl2.0μl/50μl12孔板421ml1.6μg/100μl1.0μl/100μl35mm板1052ml4.0μg/250μl10μl/250μl6孔板1052ml4.0μg/250μl10μl/250μl60mm板20105ml8.0μg/0.5ml20μl/0.5ml10cm板603015ml24μg/1.5ml60μl/1.5ml注意：表面积是根据培养容器的实际测量得到，但也会根据容器生产商的不同发生变化。优化转染：为了得到高的转染效率和低的无用副效应，通过改变细胞浓度、DNA以及LipofectamineTM2000的浓度来优化转染条件。另外，要保证细胞培养基的细胞混浊度高于90%，DNA(μg)与LipofectamineTM（μl）2000的比例在1：0.5到1：5之间。