透射电子显微镜(2)

透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscopeTEM）TEM具有和光镜相似的结构系统,由电子枪产生的电子射线作为光源,由电磁透镜代替光镜中用玻璃制成的聚光镜、物镜和目镜TEM镜体结构相当复杂，镜筒内部要求高真空状态第一节透射电镜结构和工作原理一、透射电镜结构二、透射电镜工作原理★第二节透射电镜样品制备技术一、超薄切片技术★二、特殊组织样品制备第一节透射电镜的结构和工作原理照明系统：电子枪、会聚透镜镜筒{成像系统：样品室、物镜、中间镜、投影镜观察记录系统：观察室、底片室真空系统：机械泵、油扩散泵、真空管等辅助{电源系统：高压电源、透镜电源、调压器等水冷系统：循环水泵等一、透射电镜的基本结构（一）电子束与电磁透镜＆电子束在真空中运动的速度与加速电压有关（阳极）加速电压越高，电子束的波长越短(根据光学阿贝公式原理，一台仪器的成像最高分辨率，约为它使用信息传递媒介波长的一半。电镜之所以能获得很高的成像分辨率，是由于它的电子束波长远较可见光的波长为短）＆电磁透镜的焦距与磁场（线圈组成，当电流通过时产生磁场）强度有关,磁场越强，焦距越短，放大倍率越高二、透射电镜的工作原理（二）电镜图像形成任何物质都是由原子组成的，当均匀的电子束穿过样品时会受到样品上信息的处理多数电子可从原子和原子之间的空隙穿过，极少部分电子与原子核和轨道电子发生碰撞而形成散射电子散射电子能力强的地方透过电子数目少打在荧光屏上所发出的光弱，显现为暗区散射电子能力弱的地方透过电子数目多打在荧光屏上所发出的光强显现为亮区样品结构不同散射电子的能力不同，结果？第二节透射电镜样品制备技术一、常规样品制备技术超薄切片技术※负染技术二、特殊样品制备技术电镜酶细胞化学技术免疫电镜技术电镜原位杂交技术等普通光镜切片厚度约5µm左右—石蜡切片透射电镜切片厚度在50nm左右—超薄切片（100nm以下）目前有关生物体的各种组织、细胞的形态结构知识大部分是超薄切片技术所提供一、超薄切片制备技术取材预固定后固定脱水浸透包埋修块切片染色超薄切片技术的基本操作程序快尽量保持其生活状态，在1分钟内固定小1mm³的小块轻不要牵拉、锯、挤压组织冷4℃保存（一）取材1、固定目的把在活体状态时的结构尽可能完整保存下来2、常用固定剂⑴戊二醛（glutaraldehyde）对糖原、糖蛋白、尤其是微管、内质网⑵四氧化锇(osmiumtetroxide,OSO4)对含蛋白质、脂肪性物质有良好的固定作用特别对磷脂蛋白膜的结构有良好的保存作用（二）固定⑶高锰酸钾(potassiumpermangauate)对磷脂蛋白类有特别良好的固定作用尤其对神经髓脂质的保护更为显著⑷甲醛（formaldehyde）对酶活性的保存却优于戊二醛在电镜细胞化学中常采用3固定方式⑴组织块浸泡固定取数块1mm³的组织块迅速浸泡于固定液中⑵体内原位固定适用于动物实验，将动物麻醉解剖，暴露所需的组织或器官，立即用预冷的戊二醛滴到上面直到组织适度变硬，再取数块组织固定⑶灌流固定多用于脑、肾赃、视网膜和睾丸等组织将固定液经血液循环灌流到动物体内,把活细胞在原位及时固定指将样品内所含的游离水分完全清除的过程(常用的脱水剂为乙醇和丙酮)50%乙醇10～15分钟4℃70%乙醇10～15分钟4℃80%乙醇10～15分钟4℃90%乙醇10～15分钟4℃100%乙醇3次，每次10分钟，室温（三）脱水经脱水处理的样品，即可用包埋剂进行浸透浸透利用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂使细胞内外所有空隙都被包埋剂填充包埋浸透好的样品块放入灌满包埋剂的胶囊或适当的模具中经过紫外线照射或加温聚合，即可制成包埋块包埋剂环氧树脂618、Epon812LowiscrylK4M低温树酯包埋剂（四）浸透与包埋（半薄切片的意义：1、选取超薄切片的部位超薄切片的面积一般要小于0.5mm2，要经过半薄切片选取有意义的部位（对肾脏、胰腺、脑、肌组织等更重要）2、对同一部位进行光、电镜对比观察通过半薄切片可以在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质，有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系。五、半薄切片热膨胀推进式切片机利用金属杆加热产生的微小长度变化提供进给机械推进式切片机用微动螺旋和微动杠杆来提供微小进给超薄切片机(Ultrotome)六、超薄切片◆安装包埋块、安装玻璃刀、调整包埋块和刀的距离、调节水槽高度与灯光的位置、调节水槽液面、选择切片速度及进给厚度、片子切出后，漂浮在水槽的液面上，经展片后捞到载网上◆判断切片厚度：一般利用切片表面反射的光和从切片下面反射光发生干涉所产生的干涉色为依据不同厚度的切片在显微镜下呈现不同的干涉色灰色40-50nm银灰色50-70nm金黄色70-90nm紫色90nm以上切片操作电镜图像反差是由于电子束经过样品时电子散射程度不同产生的散射的电子数越多，图像越？散射的电子数越少，图像越？◆重金属化合物有较强的电子散射能力,所以经过重金属染色的样品呈现较强反差七、电子染色常用的染色剂有醋酸铀和枸橼酸铅◆醋酸铀（Uranylacetate）能与细胞内多种成分结合，尤其对核酸核蛋白等有较强的结合能力◆枸橼酸铅(leadcitrate)能提高细胞膜系统及其脂类的反差(一)骨组织样品制备方法（二）培养细胞样品制备方法（三）血细胞样品制备方法（四）石蜡包埋样品转制方法二、几种特殊组织的样品制备方法1.将新鲜骨组织锯成2—3mm厚的骨片，立即投入固定液中24小时（4℃）。2.漂洗后投入脱钙液中在室温或4℃下进行脱钙（正常密质骨脱钙时间一般为3-4周，松质骨为7-10天，4℃脱钙时间应适当延长）3.脱钙后再将样品修成1mm3大小，然后充分浸泡，再按常规方法进入后固定、脱水、浸透包埋、半薄、超薄切片和电子染色。(一)骨组织样品制备方法脱钙液配制乙二胺四乙酸二钠40-50g双蒸馏水500ml0.2mol/LNaOH350ml双蒸馏水加至1000ml1、将培养瓶内的培养液倒掉，加入预冷的2.5%戊二醛固定2、用橡皮刮子将全部细胞从管壁上轻轻刮下，收集在离心管内离心（2000转/分）15-20分钟3、弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花纸包裹起来，然后进行漂洗等后面的程序二、培养细胞样品制备方法负染色技术主要用于细菌、病毒、噬菌体等微生物大分子结构、亚细胞碎片以及分离的细胞器等研究工作又称阴性染色，指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小三、负染色技术((Negative）当把有些重金属的盐溶液与生物材料的悬浮液混合以后，重金属的盐类不是被样品成分所吸收，而是沉淀到样品四周如果样品具有高低不平表面结构，染液还能穿透进表面的凹陷部分。这样在重金属元素沉淀的地方，散射电子的能力增强，因而样品四周表现为暗区，而在有样品的地方散射电子能力弱，因而表现为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来目前，对其染色原理还不十分清楚，有密度反差原理和异常反差原理二种观点。（一）负染技术的原理1.染色液目前最常用的为磷钨酸（Phosohotungstate）配制成2-4%磷钨酸水溶液磷钨酸的密度约为4，而生物标本的密度为1外周染料密度与标本密度相差4倍直径很小的物体可被清晰地显现出来2.染色方法负染色所用的样品全部取自悬浮液将带有样品的悬液，滴于有支持膜的铜网上，静止数分钟后滴上染液数秒钟到2分钟，随后进行电镜观察（二）负染样品的制备第三章重点电子枪发射电子经会聚透镜会聚成电子束投射在样品上，电子直接穿透样品产生透射电子，透射电子带有样品信息，经成像系统放大投射到观察室的荧光屏上，荧光屏将电子影象转化为可见光影象以供使用者观察透过的电子多荧光屏亮，反之荧光屏暗，荧光屏的亮、暗程度与样品微细结构一一对应，最终产生具有一定反差的黑白影像一、透射电镜工作原理LMTEM照明源光线电子分辨率0.2µm0.1nm放大1000×150万×透镜玻璃磁透镜应用显微水平亚显微水平二、光镜和电镜比较比较快尽量保持其生活状态，在1分钟内固定小1mm³的小块轻不要牵拉、锯、挤压组织冷4℃保存取材→固定→脱水→浸透→包埋→切片→染色三、取材要领四、超薄切片程序又称阴性染色，指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负反差，衬托出样品的形态和大小.主要用于细菌、病毒等的研究1.选取超薄切片的部位(定位)2.对同一部位进行光、电镜对比观察五、负染色六、半薄切片的意义