多肽和KLH偶联(1)

MBS/BDB/SMCC/sulfo-SMCC1、SMCC琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯分子一端的NHS酯基团与某一蛋白质分子的伯氨反应形成稳定的酰胺键，另一端(马来酰亚胺基团一端)可与另一蛋白质分子的巯基交联。NHS活性酯与伯胺在PH7-9的环境形成酰胺键。马来酰亚胺与巯基在PH6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。在水溶液中，NHS活性酯的水解是（与氨基的反应）个竞争反应。马来酰亚胺比NHS稳定，但是在PH大于7.5时，马来酰亚胺会慢慢水解，失去与巯基反应的特异性。因而，在使用SMCC时通常是在PH7.2-7.5的环境下进行，并且先让NHS发生反应。SMCC结构里的环己烷环可以降低马来酰亚胺的水解速率。这使得蛋白质在用SMCC修饰之后可以冻干存放一段时间。很多蛋白质都选用该试剂来进行马来酰亚胺修饰。用SMCC来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋白质，经常采用两步合成法。首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应完的SMCC。然后，再与含有巯基的蛋白质反应。在实际操作中要注意的是，SMCC怕潮湿，存放时要和干燥剂一起存放。并且使用中从冰箱拿出来时要先在室外放置一段时间平衡温度，以免立刻开启，空气中水分遇冷凝结，破坏SMCC结构。1、将20mgSMCC（这是联接40条多肽的量）溶于2mlDMF。2、将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。3、将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。4、用1L1×PBS(PH7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。5、将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mgKLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。例如：反应前加2、入KLH蛋白的量为120mg，透析后的KLH蛋白体积为20ml，那么透析后的KLH蛋白浓μlKLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。6、将3.0mg多肽用0.6ml1×PBS(pH7.2)溶液溶解。注意：这里多称量出0.5mg多肽是用来做ELISA检测的，取出100μl即可。检测多肽随交联好的抗原一起寄出，浓度为5mg/ml。7、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412nm下测其紫外吸收值，如果OD值0.15做下一步；OD值0.15并0.05补加多肽，直至达到要求；OD值0.05返回多肽合成步骤重新质控。Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。8、将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。9、用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂储备液，再加入10μl教练后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ=412nm下测定紫外吸收值。OD值0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80%以上；OD值0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。