第十章-基因工程生化产品制备原理及方法

生化工艺学课件第十章基因工程生化产品制备原理及方法第十章基因工程生化产品制备原理及方法§10.1概述§10.2基因工程生化产品的制备程序§10.3大肠杆菌表达系统的优化§10.4非大肠杆菌表达系统§10.5工程菌的发酵§10.6基因工程生化产品的分离纯化§10.7基因工程生化产品的质量控制§10.8重组白细胞介素-2的制备§10.9干扰素的制备§10.10人胰岛素的制备§10.1概述生物技术最为活跃的研究领域为医学领域→集中于开展活性蛋白和多肽类药物及单克隆抗体的研究人类基因组学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究的进展，转基因动物与植物、蛋白质工程、抗体工程、基因治疗和生物芯片等新技术的建立且取得重大突破与发展→新型生物技术产业第一个生物技术药物：人胰岛素，1982年生物技术医药产业1993年生物技术医药产品销售达77亿美元，2000年已超过200亿美元已得到临床应用的基因工程药物有：人胰岛素、人生长激素、干扰素、乙肝疫苗、人促红细胞生成素（EPO）、GM－集落刺激因子（GM－CSF）、组织溶纤酶原激活素、白细胞介素－2及白介素－11等。正在研究的有降钙素因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等140多种。随着生物技术药物的发展，多肽与蛋白质类药物的研究与开发，已成为医药工业中一个重要的领域，同时给生物制剂带来了新的挑战。蛋白质药物的应用限制实际应用中，蛋白质类药物受到一定限制，大多数只能注射给药或局部用药。Why？为克服这些缺陷→合成这些天然蛋白质的较小活性片段，即“多肽模拟”或“多肽结构域”，又叫“小分子结构药物设计”。可口服，有利于由皮肤、粘膜给药，用于治疗免疫缺陷症、HIV感染、风湿性关节炎等，其制造成本也更低。该设计思想也已应用于多糖类药物、核酸类药物和模拟酶的有关研究。小分子药物设计属于第二代结构相关性药物设计，能替代原先天然活性蛋白与特异靶相互作用口服应用时生物利用度低，会受到消化酶的破坏，在胃酸作用下不稳定，在体内半衰期较短在给药方式的研究方面，对注射用溶液和注射用无菌粉末（目前上市的多肽蛋白质类药物多为此种剂型），除了继续改进其稳定性外，还通过一些其他技术手段，研制出了化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。如PEG修饰能有效地改善多肽蛋白质类药物的免疫原性，增加稳定性，延长体内半衰期，减少毒副作用等。PEG-腺苷脱胺酶已投放市场，PEG-天冬酰胺酶，PEG-IL-2，PEG-SOD，均已进入临床。非注射途径的给药如鼻腔、直肠、肺部给药方面也取得重大进展。基因工程药物的研究进展第一代基因工程药物是针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病。应用基因工程技术去扩大这类多肽蛋白质的产量以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的需要，主要是以蛋白质激素类为代表的，如人胰岛素、胰高血糖素、人生长激素、降钙素、生长激素及α-EPO等。第二代基因工程药物是根据内源性多肽蛋白的生理活性，应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质，以超正常浓度剂量供给人体，以激发它们的天然活性作为其治疗疾病的药理基础，主要是以细胞生长调节因子为代表的，如G-CSF，GM-CSF，α-IFN，γ-IFN和tPA等。基因工程药物的研究进展应用重组DNA技术表达人源性抗体或将抗体小型化(如Fab抗体，单链抗体、单域抗体，分子识别抗体等)，与非人源化抗体和完整抗体相比，其免疫原性弱，穿透力强，表达效率高。人源化抗体药物和小型化抗体靶向药物正成为肿瘤治疗，自身免疫性疾病，器官移植排斥和艾滋病防治药物的又一研究热点。利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。从1982年重组胰岛素批准上市以来，现已有近40种基因工程蛋白质药物投放市场，主要用于治疗癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌感染、骨损伤、创伤、代谢病等疑难病。近年来，利用转基因植物生产基因工程疫苗和利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物的研究也取得重大进展。1、转基因植物基因工程疫苗1990年以来利用转基因植物生产基因工程疫苗的研究得到了迅速的发展。将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入该植物或其中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。转基因植物生产疫苗的研究主要集中在烟草、马铃薯、蕃茄、香蕉等植物。2、转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物利用转基因动物乳腺作为生物反应器，生产基因工程人类蛋白质药物，其成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低→近年不少研究者从事转基因动物乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究。基本方法：将药用蛋白质基因连接到乳汁蛋白质基因的调节元件下游，然后将连接产物显微注射到哺乳动物受精卵或胚胎干细胞，当转基因胚胎长成个体后，在泌乳期药用蛋白质基因表达，从动物乳汁可获得基因工程药物。2、转基因动物乳腺生物反应器1988年开始在大哺乳动物乳腺生物反应器中表达基因工程药物以来，在动物的奶汁中生产出的人类蛋白质药物：牛奶：抗凝血酶、纤维蛋白原、人白血清蛋白、胶原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基转移酶、蛋白C等；山羊奶：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、组织型溶纤维原激活因子、单克隆抗体；绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纤维蛋白原、蛋白质C，猪奶中亦有蛋白质C、凝血因子IX、纤维蛋白原、血红蛋白。乳腺生物反应器生产基因工程药物的研究已取得了一些成功经验，但离商业化生产还有距离。§10.2基因工程生化产品的制备程序现代生物技术生化产品：将生物体内生物活性物质的基因分离出来，然后用重组DNA技术加以改造，使其在细菌、酵母、动物细胞或转基因动物中大量表达，通过这种方式生产的新型生化产品基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌或细胞，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术→使得很多从自然界很难或不能获得的蛋白质得以大规模合成一、基因工程研发的程序1）制备基因工程菌株（或细胞）及实验室小试阶段→主要涉及到DNA重组技术（基因工程上游技术）2）中试与质量检定阶段→主要涉及基因工程产物的分离、纯化（基因工程下游技术）3）临床前研究阶段4）临床试验阶段5）试生产阶段二、基因工程的基本过程通过对核酸分子的剪接、重组和插入而实现遗传物质重新组合，再借助质粒、病毒、细菌或其它载体，将重组基因转移到新宿主细胞，使其在新宿主细胞系统内复制和表达1）目的基因的制备2）载体的制备3）目的基因与载体的连接4）将含目的基因的表达载体引入受体细胞并在其中复制表达5）筛选带有重组目的基因的转化子6）鉴定目的基因的表达产物基因工程生化药物的生产上游阶段：分离目的基因、构建工程菌（细胞）；主要在实验室完成；目的基因获取后，要选择适当的表达系统→原核系统和真核系统。主要考虑的是要保证蛋白质的功能，其次考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易下游阶段：从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。包括:工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器的设计和制造。与传统发酵不同，需对影响目的基因表达的因素进行分析三、获得目的基因合成一段与目的DNA双链的两个3‘末端部分序列互补的、20余个碱基的寡核苷酸作为引物（primer）目的DNA变性后（单链模板），加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热聚合酶。T↓，引物将与待扩增的DNA链复性结合，在聚合酶的作用下，不断延伸合成新互补链（1条DNA双链→两条）。变性（90-95℃）→复性（50-55℃）→引物延伸（60-72℃）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段（可使DNA扩增100余万倍）。PCR反应特异性强，灵敏度高，极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。1、利用聚合酶链式反应获得基因来源于真核细胞的产生基因工程生化产品的目的基因，不能直接分离、克隆，Why？PCR反应设计引物时，可根据需要，在5‘延伸，添加限制酶识别序列及转录和翻译调控序列，或者利用碱基错配，对5’端密码子进行定点诱变，以改造翻译起始区序列，提高基因表达效率2、从DNA文库筛选基因1）制备基因文库a.基因组文库：由一种生物的基因组得到的DNA片段的集合，其中每个片段都连接到一个克隆载体上，该种生物的全部遗传信息由文库中的全部DNA片段代表。制备或选择克隆载体→限制性酶局部消化基因组DNA→用蔗糖密度梯度离心法除去不适合克隆到选定载体中的片段→将基因组DNA片段和切开的载体DNA混合、连接→用连接物转化细菌细胞（载体为质粒）或体外包装成噬菌体颗粒（载体为噬菌体）→得到含有不同重组DNA分子的基因组文库b.cDNA文库：只含有在一定生物或一定细胞和组织中表达的基因表达目的基因的细胞中提取总RNA，寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从总RNA中提取mRNA，以mRNA为模板，利用逆转录酶合成互补DNA，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链，将产生的双链cDNA片段插入到适当的载体中克隆RNA转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，cDNA文库适于在原核中表达，但cDNA只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列（需根据表达载体的结构配以相应的调控序列）真核生物基因中通常含有非编码区及内含子，在原核细胞宿主中不能正常表达，基因库中的基因一般不能用于原核表达系统的基因工程2）DNA文库中筛选目的基因每个基因都有唯一的核苷酸序列，利用与该基因互补的标记DNA片段（探针）检出目的基因探针可用放射性同位素标记，也可用非放射性物质如生物素、地高辛、荧光素等标记作为探针的DNA片段，可为另一物种克隆的同源基因，也可为根据目的基因产物蛋白质的氨基酸序列和遗传密码知识设计合成的寡核苷酸序列利用标记DNA探针从DNA文库中筛选目的基因的方法：1）硝酸纤维素膜或特制尼龙膜印在含有许多单菌落的琼脂平板上（每个菌落都含有不同的重组DNA），每个菌落都有一些细胞黏在膜上，形成平板影印膜2）碱处理滤膜，变性后DNA仍留在原来菌落的位置3）标记探针加到滤膜上，只与含有互补DNA序列的目的基因退火，使相应菌落所在位置带上标记4）通过放射性自显影显现标记的菌落（目的基因的克隆）许多生长因子的早期基因工程都是利用cDNA基因3、人工合成基因已知蛋白质的氨基酸序列或其基因的核苷酸序列，可利用DNA合成仪合成编码该蛋白的基因现有DNA合成仪能力限制，先需分段合成目的基因的核苷酸序列，再将这些片段连接成完整基因可根据需要修改密码子：采用宿主细胞偏爱的密码子；在结构基因的适当位置添加转录和翻译调控序列；在目的基因的两侧添加限制酶识别序列，以利于和载体的连接许多细胞生长因子：胰岛素、表皮生长因子、干扰素、EPO等都采用了人工合成基因4、载体的制备与连接表达载体除了具有一般克隆载体的特性外，还需有强的启动子、增强子、终止子及翻译调控序列如SD序列等表达载体的构建或选择由所用宿主类型和表达战略两因素决定不同的宿主有不同的表达载体；大肠杆菌表达系统可采用直接表达、融合表达和分泌型表达三种不同战略非融合表达载体：pBV220；pET系统；分泌型表达载体等（共有24种核酸内切限制酶对pBR322DNA分子只具有单一识别位点。其中有9种限制酶其识别位点位于四环素抗性基因区，还有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活→因DNA插入而导致基因失活的现象称为插入失活效应。）具有较小的分子量(4361bp)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号（每个细胞中可累积1000～3000个拷贝）具较高的拷贝数5、目的基因与载体连接根据目的基因和载体制备过程中产生的末端性质不同，可采用黏性末端连接、平头末端连接和人工接头连接三种不同的连接策略6、转化：细胞在一定生理状态即感