SNT 2351-2009 出入境口岸军团菌检验规程

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２３５１—２００９出入境口岸军团菌检验规程犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犮狅犱犲狊狅犳犾犲犵犻狅狀犲犾犾犪犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２００９０７０７发布２０１００１１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前　　言　　本标准的附录Ｂ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ、附录Ｄ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱玉兰、吴兵、高朝贤、朱海、杨泽、叶健忠、古莉冰、刘志明。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网出入境口岸军团菌检验规程１　范围本标准规定了出入境口岸军团菌检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定、处置。本标准适用于出入境口岸军团菌的检验。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＷＳ１９５　军团病诊断标准及处理原则３　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１军团病　犾犲犵犻狅狀狀犪狉犻狉犲狊’犱犻狊犲犪狊犲，犔犇军团菌属（主要是军团菌）引起的细菌性呼吸道传染病，临床表现有两种类型：非肺炎型和肺炎型。３．２军团菌　犾犲犵犻狅狀犲犾犾犪引起军团病的病原菌，系兼性细胞内寄生的革兰阴性杆菌，军团菌是人军团病的主要致病菌。４　实验室生物安全防护实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备及个体防护应符合ＧＢ１９４８９中二级生物安全防护实验室的要求。５　对象５．１　疑似感染军团菌的出入境人员。５．２　环境污染标本。６　准备６．１　检验试剂６．１．１　细菌培养鉴定及聚合酶链反应（ＰＣＲ）试剂的制备参见附录Ａ，或购买符合要求的商品化检测试剂盒。６．１．２　直接荧光抗体染色（ＤＦＡ）、血清学检验及尿抗原检测见ＷＳ１９５或购买符合要求的商品化试剂。６．２　仪器设备仪器设备参见附录Ａ。１犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网７　标本的采集和处理７．１　疑似感染者标本的采集７．１．１　发病期患者的痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织可进行病原学检测，常规采样后立即送检，采样过程中应使用无菌蒸馏水。７．１．２　无菌方法采集发病期患者胸水，用有盖无菌试管保存，立即送检。７．１．３　用于培养的尿液标本采样前应清洗并消毒患者尿道口，留取中段尿１０ｍＬ～２０ｍＬ于无菌容器中，立即送检。用于尿抗原检测的标本可常规留取中段尿。７．１．４　用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期（发病３ｄ内）、第３周、第６周血清用于血清学检测。７．２　疑似感染者标本的处理７．２．１　肺组织用蒸馏水在无菌条件下制成悬液，痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液、肺组织悬液经酸处理或热处理后进行培养（见７．５）。７．２．２　无菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿、血液等正常情况下无菌的标本无需处理直接用于培养。７．２．３　血清学试验的血液采集后室温放置１ｈ后，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，分离出血清。７．３　环境污染标本采集水样用无菌容器采集２００ｍＬ～５００ｍＬ，尘土和泥土用无菌蒸馏水制成悬液。水样中如果含有含氯或其他氧化剂，应在取样时或取样前加入硫代硫酸钾或相应的非活性试剂中和。从样品采集、浓缩到送检间隔不超过２ｄ，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析。７．４　环境污染标本处理７．４．１　膜过滤法采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径４７ｍｍ～１４７ｍｍ，孔径０．２２μｍ的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加１５ｍＬ的无菌稀释液或无菌蒸馏水，不断摇动至少２ｍｉｎ。也可将容器放入超声波中１０ｍｉｎ。７．４．２　离心法取２００ｍＬ样品于３００ｍＬ～５００ｍＬ容积的离心瓶中，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ或３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，保持温度在１５℃～２５℃，弃去上清液，将沉淀物悬浮在１５ｍＬ无菌蒸馏水中。７．５　酸处理和热处理７．５．１　处理目的为减少痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等正常情况有菌的标本和环境污染标本中的杂菌生长，标本需进行酸处理或热处理。同一容器内的标本只能选择酸处理或热处理中的一项，两种处理方法不能重复。７．５．２　酸处理取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等标本２ｍＬ，转移至有盖无菌试管中。取经７．４处理过的环境污染标本１０ｍＬ，转移至有盖无菌试管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，用无菌枪头吸去８ｍＬ体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物。每个装有２ｍＬ标本的有盖无菌试管中加入８ｍＬｐＨ２．０酸性缓冲液，混匀，室温静置１０ｍｉｎ。加入碱中和试剂，调至未加酸性缓冲液时的ｐＨ值，静置１０ｍｉｎ，待查。７．５．３　热处理取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等临床标本或环境污染标本２ｍＬ，转移至有盖无菌容器中，５０℃±１℃水浴处理３０ｍｉｎ±２ｍｉｎ。２犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网８　实验室检验方法８．１　细菌培养鉴定，见附录Ｂ。８．２　尿液中抗原的检测，采用免疫层析法，按照相应商品化试剂说明书（以美国Ｂｉｎａｘ公司ＮＯＷ试剂为例），参见附录Ｃ。８．３　聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测，参见附录Ｄ。８．４　直接荧光抗体染色按照ＷＳ１９５。８．５　血清学检测按照ＷＳ１９５或按照商品化试剂说明书。注：其他符合检测要求的商品化试剂盒，在验证合格后均可参照使用，本标准不做推荐。９　结果判定与报告９．１　细菌培养鉴定报告９．１．１　标本中培养出军团菌，报告“细菌培养检出军团菌”。９．１．２　ＢＣＹＥα培养基或ＧＶＰＣ培养基１４ｄ内未见可疑菌落，报告“细菌培养１４ｄ，未检出军团菌”。９．２　尿抗原检测报告９．２．１　尿抗原检测阳性，报告“尿军团菌抗原阳性”。９．２．２　尿抗原检测阴性，报告“尿军团菌抗原阴性”。９．３　犘犆犚检验报告９．３．１　ＰＣＲ检测阳性，报告“军团菌ＰＣＲ检测阳性”。９．３．２　ＰＣＲ检测阴性，报告“军团菌ＰＣＲ检测阴性”。９．４　血清学试验报告９．４．１　血清学试验阳性，报告“军团菌抗体阳性”。９．４．２　血清学试验阴性，报告“军团菌抗体阴性”。１０　阳性结果的处置１０．１　细菌分离培养阳性的菌株应传代保存，疫情报告上级主管部门，同时向当地卫生行政主管部门及疾病预防控制中心通报。１０．２　血清学检测、尿抗原检测结果阳性或可疑阳性的标本，宜选择直接免疫荧光抗体染色及细菌分离培养和ＰＣＲ方法进行复检验证。３犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网附　录　犃（资料性附录）军团菌检验主要试剂及器材犃．１　主要试剂犃．１．１　培养基的主要成分及制备方法犃．１．１．１　犅犆犢犈α培养基配方Ｎ２乙酰氨基２氨基乙烷磺酸（ＡＣＥＳ）　　　　　　　１０．００ｇ酵母浸膏（细菌学级）１０．００ｇ可溶性焦磷酸铁０．２５ｇ活性炭１．５０ｇ琼脂１７．００ｇＬ半胱氨酸０．４０ｇ氢氧化钾（分析纯）２．８０ｇα酮戊二酸一钾盐１．００ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．１．２　犅犆犢犈α培养基制备方法将ＡＣＥＳ加到含９００ｍＬ蒸馏水的烧瓶中，置５０℃水浴约１ｈ，直到ＡＣＥＳ完全溶解。将干燥的活性炭、酵母浸膏、琼脂和α酮戊二酸加入溶液中，充分混合。再加入８０ｍＬ蒸馏水，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，取出后，放５０℃～５５℃水浴中保温。将Ｌ半胱氨酸、焦磷酸铁分别溶于１０ｍＬ蒸馏水中，并用０．２２μｍ孔径的滤菌器过滤除菌，加入上述液体中，充分混匀。用１ｍｏｌＫＯＨ调整ｐＨ至６．９０。犃．１．１．３　犅犆犢犈犆狔狊培养基ＢＣＹＥα培养基配方去掉Ｌ半胱氨酸，按Ａ．１．１．２方法制备。犃．１．１．４　犌犞犘犆选择性培养基按Ａ．１．１．２方法制备，在加入Ｌ半胱氨酸、焦磷酸铁后，每升另加入：甘氨酸　　　　　　　３．００ｇ万古霉素５．００ｍｇ放线菌酮８０ｍｇ多粘菌素Ｂ１０万Ｕ犃．１．１．５　酸性缓冲液Ａ液：０．２ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液（１４．９ｇ／Ｌ）Ｂ液：０．２ｍｏｌ／Ｌ盐酸（１７．２ｍＬ／Ｌ）取１８份Ａ液和１份Ｂ液，混匀，ｐＨ为２．０。犃．１．１．６　碱中和试剂的配制Ｃ液：０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钾溶液（６．４６ｇ／Ｌ）取Ｃ液１０．７ｍＬ加８９．３ｍＬ蒸馏水，ｐＨ为１３．０。犃．１．２　犘犆犚试剂犃．１．２．１　Ｔｒｉｓ盐酸（ｐＨ８．８），１８１．７ｇ／ＬＴｒｉｓ，浓盐酸调整ｐＨ值。犃．１．２．２　ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ盐酸（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。犃．１．２．３　１０×ＰＣＲ缓冲液：５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾（ＫＣｌ），４０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁（ＭｇＣｌ２），１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ盐酸，ｐＨ８．５。４犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网犃．１．２．４　电泳缓冲液：２４２ｇＴｒｉｓ碱，５７．１ｍＬ冰乙酸，１００ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），加蒸馏水至１０００ｍＬ，使用时１０倍稀释。犃．１．２．５　２０×ＳＳＣ缓冲液：在８００ｍＬ蒸馏水中溶解１７５．３ｇ氯化钠（ＮａＣｌ）和８８．２ｇ柠檬酸钠，加入数滴１０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠（ＮａＯＨ）溶液调节ｐＨ值至７．０，加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌。犃．１．２．６　琼脂糖（电泳级）犃．２　器材犃．２．１　细菌培养器材———培养皿（７０ｍｍ、９０ｍｍ）；———蠕动泵；———滤膜滤器；———旋涡振荡器；———离心机；———光学显微镜；———解剖显微镜；———全排式生物安全柜；———ＣＯ２恒温培养箱；———０．２２μｍ除菌滤膜；———高压蒸汽灭菌器；———玻璃吸管（２ｍＬ、５ｍＬ）、量筒（５０ｍＬ、２００ｍＬ）、三角烧瓶（２００ｍＬ、１０００ｍＬ）；———电子天平秤（精确到０．０１ｇ）；———普通冰箱。犃．２．２　犘犆犚器材———离心机；———ＰＣＲ仪；———电泳仪；———可调移液器：１μＬ～１０μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ；———凝胶成像仪。５犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网附　录　犅（规范性附录）细菌培养鉴定犅．１　初培养将酸处理或热处理的标本３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用无菌吸管吸弃上清液，保留１ｍＬ重新悬浮沉淀物，正常情况无菌的标本直接用于培养。用无菌吸管吸取沉淀物悬液或正常情况无菌的标本，分别滴加１滴～２滴在ＢＣＹＥα军团菌专用培养基和ＧＶＰＣ选择性培养基上，划线接种或涂布接种。３５℃，５％ＣＯ２培养箱中培养，连续观察３ｄ～７ｄ，军团菌在ＢＣＹＥα培养基上的菌落通常呈现白色、灰色、蓝色、紫色，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。发现上述菌落即为军团菌可疑菌落，进行下一步分离培养鉴定。无可疑菌落，培养顺延到１４ｄ，报告“细菌培养１４天，未检出军团菌”。犅．２　分离培养挑取初培养可疑菌落分别在ＢＣＹＥα培养基和ＢＣＹＥＣｙｓ培养基或血平板上划线接种。３５℃，５％ＣＯ２培养箱中培养。观察２ｄ～４ｄ，在ＢＣＹＥα培养基上见到菌落形成而ＢＣＹＥＣｙｓ或血平板上未见生长，即初步判定为军团菌，用军团菌诊断血清做分型试验进一步验证。聚合酶链反应（ＰＣＲ）可辅助用于军团菌的鉴定，作为参考。６犛犖／犜２３５１—２００９食品伙伴网附　录　犆（资