SNT 2853-2011 闭合孢子虫病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５３—２０１１闭合孢子虫病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犿犻犽狉狅犮狔狋狅狊犿犪犮犽犻狀犻２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准闭合孢子虫病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８５３—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张１．７５　字数４９千字２０１１年１１月第一版　２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６７１　定价２７．００元书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准是参考采用ＯＩＥ的《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）中２．２．５章《闭合孢子虫感染》（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｍｉｋｒｏｃｙｔｏｓｍａｃｋｉｎｉ），对涉及组织学、透射电镜及原位杂交检测的部分内容进行了补充和完善。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局和中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘荭、陈信忠、龚艳清、王景明、周斌华、徐彪。Ⅰ犛犖／犜２８５３—２０１１闭合孢子虫病检疫技术规范１　范围本标准规定了用于检测牡蛎闭合孢子虫病的临床诊断方法、组织印迹法、组织切片法、透射电镜法、ＰＣＲ方法和核酸原位杂交等方法。本标准适用于牡蛎闭合孢子虫病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　材料和设备３．１　试剂和材料除另有规定外，下列所用生化试剂均为分析纯。试剂配制方法见附录Ａ。实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。３．１．１　组织切片制备和染色试剂：姬姆萨（Ｇｉｅｍｓａ）染液、苏木精伊红染色液、伊红染液、俾斯麦棕Ｙ、返蓝液：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ液、甲醛、戊二醛、涂有氨基烷基硅烷的载玻片、盖玻片、石蜡、Ｅｐｓｏｎ８１２、ＤＮＰ３０、ＤＤＳＡ（十二烷基琥珀酸酐）、ＭＮＡ（六甲酸酐）。３．１．２　ＤＮＡ提取试剂：蛋白酶Ｋ、酚三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他ＤＮＡ抽提试剂盒。３．１．３　ＰＣＲ试剂：１０×ＰＣＲ缓冲液（不含镁离子）、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、５Ｕ／μＬＨｏｔｓｔａｒｔ犜犪狇聚合酶、ＤＮＡＭａｋｅｒＤＬ２０００、６×电泳上样缓冲液等，均为商品化试剂盒中成分。琼脂糖５×电泳缓冲液（ＴＢＥ）。３．１．４　有机试剂：甲醇、无水乙醇、丙酮、甘油、异丙醇、二甲苯、氧化丙烯、封片树胶和液氮。３．１．５　无机试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、叠氮钠、醋酸铀、柠檬酸铅和海水。３．１．６　引物及探针：包括一对ＰＣＲ引物和地高辛标记的核酸探针，均根据ＳＳＵｒＤＮＡ的基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４７７６２３：该虫大小为１４５７ｂｐ片段的序列）设计。上游引物：５’ＡＧＡＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣ３’（１９ｂｐ，位置３１８～３３６）下游引物：５’ＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＣ３’（１７ｂｐ，位置８４７～８６３）该对引物扩增产物大小为５４６ｂｐ。探针：３’端用地高辛标记的探针序列，序列为５’ＡＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣ３’地高辛（１６ｂｐ，位置１２８７～１３０２）。３．１．７　阴性和阳性对照：由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。３．２　设备３．２．１　切片机。３．２．２　组织匀浆研磨器。１犛犖／犜２８５３—２０１１３．２．３　ＰＣＲ仪。３．２．４　扫描电子显微镜。３．２．５　制冰机。３．２．６　生物安全柜。３．２．７　核酸蛋白测定仪。３．２．８　高压灭菌锅。３．２．９　电泳仪、电泳槽。３．２．１０　旋涡振荡器。３．２．１１　高速离心机、超速离心机。３．２．１２　凝胶成像仪或紫外透射仪。３．２．１３　石蜡包埋模具和电镜包埋模具。３．２．１４　滤器和滤膜（孔径为０．２２μｍ）。４　诊断方法４．１　临床诊断方法４．１．１　临床症状闭合孢子虫病资料参见附录Ｂ。春季发生死亡或口张开的牡蛎，在软组织中（如：外壳、体壁、内收肌、唇状触须或套膜表面）可观察到含有直径达５ｍｍ的黄绿色小脓疱、溃疡或脓肿（参见附录Ｃ和附录Ｄ），显微镜观察可见细胞间有红细胞浸润；外壳上经常有褐色伤疤，与覆盖在外壳表面的脓肿或溃疡面相连；在受到损害的组织中心可能会有组织坏死现象，主要为空泡性结缔组织细胞内病灶性感染，常导致血细胞渗透和组织坏死；由粒状血细胞和透明白细胞组成的脓肿可能含有小细胞，直径１μｍ～３μｍ；除非患有脓疱，不然感染牡蛎通常直到死亡仍然表现良好，有些不表现任何临床特征。４．１．２　结果判定上述所有这些变化并不是闭合孢子虫病的特异症状，而且部分感染闭合孢子虫病的牡蛎无临床症状，需进一步通过实验室诊断确诊。４．２　采样４．２．１　采样点的选择应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取３个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品种，应增加采样点。４．２．２　采样技术要求４．２．２．１　有临床症状的牡蛎挑选濒死的或可疑的活个体。采样时牡蛎应当是活的，牡蛎应当在活体或杀死后分别包装放在密封冰藏的容器中送到实验室。所采集的牡蛎应严格避免冰冻。主要采集牡蛎的软组织，包括外壳、内收肌、唇状触须或套膜表面，尤其含有脓疱的部位。４．２．２．２　以监测为目的的采样监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能观察到该虫的温度和季节。样品应包括该地所有２犛犖／犜２８５３—２０１１的易感品种。每次采样的牡蛎数量要以感染率等于或大于２％时检出的概率进行抽样。最常见的情况是应采集１５０个以上牡蛎。对无临床症状的牡蛎，取其内收肌或套膜表面等。４．２．２．３　样品保存及运送采集的样品应在２４ｈ内送入实验室，且要附有标签，清楚标明采样时间、地点、来源和养殖历史。４．３　组织印迹法４．３．１　组织样品的选择主要采集带脓疱的感染晚期的活牡蛎。４．３．２　制片用手术刀将脓疱组织切成两半，将切面溢出的液体用吸水纸吸干，然后在干净的载玻片表面轻压做触片，在载玻片上形成薄层膜，自然干燥，丙酮固定印迹５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，用姬姆萨染色（见Ａ．１），染色５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，流水冲洗，晾干，用１０００倍油镜观察。该方法特异性很低，因为该虫与组织印迹的微细胞很相像。只是出现脓疱时用此法检测的敏感性比传统组织学方法好。４．３．３　结果判定在宿主细胞外经常可观察到微细胞，由于扭曲变形，其直径大约４μｍ，而存在其中的闭合孢子虫直径为２μｍ～３μｍ，通常有蓝色的细胞质（嗜碱性的）和一个小的红色的细胞核的判为阳性。４．４　组织切片法４．４．１　取样要求和组织切片制作流程采集濒死或刚死不久的牡蛎。制备组织块包括样品的固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片等一系列步骤。４．４．２　固定组织块将新鲜组织按照常规制作组织切片的方法制作。即将新鲜的脓疱或内收肌组织等切成１ｍｍ３左右的小块，对较大的样品，采用Ｄａｖｉｄｓｏｎ’ｓ液（见Ａ．５）或１０％甲醛（见Ａ．６）固定２４ｈ。而对较小的样品，可用３％戊二醛（见Ａ．７）固定，并且它们可兼做电镜样品。也可用海水配制固定液。为了保证有好的固定效果，固定液和组织块的体积比应为１０∶１。此时应避免固定时间过长（超过２４ｈ）。４．４．３　样品脱水、浸蜡和石蜡包埋取出固定好的组织块，修整组织块，更换固定液重新固定１２ｈ，自来水冲洗，然后按照箭头所指顺序进行脱水、浸蜡和包埋。７０％乙醇１ｈ→８５％乙醇１ｈ→９５％乙醇４５ｍｉｎ→９５％乙醇４５ｍｉｎ→无水乙醇３０ｍｉｎ→无水乙醇３０ｍｉｎ→无水乙醇二甲苯（５０∶５０）３０ｍｉｎ→二甲苯５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ→二甲苯５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ→石蜡１ｈ～１．５ｈ→石蜡１ｈ～１．５ｈ→包埋。４．４．４　制备切片当包埋了组织块的石蜡冷却固化形成蜡块后，用切片机将其切成２μｍ～３μｍ厚的薄片。把切片贴在已经硅化的载玻片上，除去水分并于６０℃干燥过夜。在此温度下能去掉剩余的潮气，使切片牢固附在载玻片上。３犛犖／犜２８５３—２０１１４．４．５　染色和封片在染色之前，先将切片在二甲苯或其他毒性相对较小的透明液中浸泡１０ｍｉｎ以除掉石蜡。重复浸泡一次后再用无水乙醇浸泡两次，每次１０ｍｉｎ，然后再在９５％乙醇、８５％乙醇和７０％乙醇中依次浸泡２ｍｉｎ以除去二甲苯，最后在蒸馏水中浸泡３ｍｉｎ重新水化。在进行染色时，按照箭头所指顺序进行，苏木精（见Ａ．２）染色５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ→自来水洗３ｍｉｎ→１％盐酸酒精（见Ａ．９）８ｓ～１５ｓ→自来水洗３ｍｉｎ→返蓝液（见Ａ．１０）２ｍｉｎ～５ｍｉｎ→自来水５ｍｉｎ→蒸馏水５ｍｉｎ→８５％乙醇２ｍｉｎ→８５％乙醇２ｍｉｎ→０．５％伊红染液（见Ａ．３）１ｍｉｎ～２ｍｉｎ→９５％乙醇２ｍｉｎ→９５％乙醇２ｍｉｎ→无水乙醇２ｍｉｎ→无水乙醇２ｍｉｎ→二甲苯２ｍｉｎ→二甲苯２ｍｉｎ→封片。苏木精伊红染色后，用１０００倍油镜观察。细胞核和嗜碱性结构染成蓝色或深紫色，内质网染成蓝色，细胞质染成灰色。而伊红把其他结构染成粉红色。虽然这种染色只使细胞结构出现很少几种不同的颜色，但足以检测组织和细胞结构中的任何不正常变化。其他染色技术也可以用来检测某些特殊的结构或者所特指的特性（如：用三色染色法给结缔组织和细胞质颗粒染色）（参见附录Ｄ）。４．４．６　结果判定在空泡性结缔组织细胞和肌细胞的细胞质里，通常是在与红细胞渗透较为严重的宿主细胞内，若找到直径大约２μｍ～３μｍ的球形微细胞，则判为阳性。对于易感宿主，假如有该虫感染的证据，就能诊断为阳性。若为非易感宿主，则可通过ＳＳＵｒＤＮＡ的基因序列的测定，与该虫大小为１４５７ｂｐ片段的序列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４７７６２３）进行比对，就能诊断是否为阳性。４．５　透射电镜法４．５．１　样品的采集和固定要求采集活的或刚死不久的牡蛎组织并尽快固定。４．５．２　固定组织块把样品用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）（见Ａ．１４）洗净，切成厚度不超过１ｍｍ３的小组织块。用３％戊二醛来固定样品２ｈ（固定时间过长会导致膜状结构变形），然后样品用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）洗３次，再用１％的锇酸（见Ａ．１５）固定２ｈ，最后用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）洗２次。如果样品事先已用Ｃａｒｓｏｎ’ｓ液（见Ａ．８）固定并保存在Ｃａｒｓｏｎ’ｓ液中，则应先用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）洗几次再用３％戊二醛固定。４．５．３　脱水和包埋样品样品在一系列的乙醇中浸泡脱水：７０％乙醇１次１０ｍｉｎ，９５％乙醇２次，每次１５ｍｉｎ，无水乙醇４０ｍｉｎ（中间换液３次）。然后在氧化丙烯中浸泡２次，每次１０ｍｉｎ，以达到完全脱水，以便随后用Ｅｐｏｎ８１２（是一种树脂）（见Ａ．１２）或其他树脂浸透。样品被逐步浸透。首先是在氧化丙烯Ｅｐｏｎ８１２包埋剂（５０／５０）（见Ａ．１３）的混合物中，３５℃浸泡４５ｍｉｎ，再放入Ｅｐｏｎ８１２包埋剂中，４５℃浸泡２ｈ。浸泡的时间越长，组织块被浸透得越好。将上述处理好的样品放入盛满新鲜Ｅｐｏｎ８１２包埋剂的包埋模具中进行包埋，方向应为保持所需组织的全层结构为准。在每个模板上写好标记，然后放在６０℃（是Ｅｐｏｎ８１２包埋剂的聚合温度）作用４８ｈ。４．５．４　切片和复染先用切片把树脂块切成适当大小，然后用超薄切片机切片。先切一些０．５μｍ～１μｍ的半薄片放４犛犖／犜２８５３—２０１１在涂有蛋白甘油加水的载玻片上，然后于３７℃烘箱内烘干待染（若急用，可于酒精灯上加热烘干）。用光镜