SNT 2833-2011 委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８３３—２０１１委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犲狀犲狕狌犲犾犪狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织公布的《陆生动物手册》（２００９年版）第２．５．１４章“委内瑞拉马脑脊髓炎”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：———细化了间接免疫荧光分型试验方法；———增加了血凝试验内容；———修改了ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ的底物作用时间为３０ｍｉｎ～３５ｍｉｎ；———删除了补体结合试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、肖进文、李应国、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、朱来华、周启明。Ⅰ犛犖／犜２８３３—２０１１委内瑞拉马脑脊髓炎检疫技术规范１　范围本标准规定了委内瑞拉马脑脊髓炎的病毒分离、间接免疫荧光分型试验、血凝抑制试验、ＩｇＭ捕获ＥＬＩＳＡ和蚀斑减数中和试验的技术要求。本标准适用于进出境动物的委内瑞拉马脑脊髓炎检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＶＥＥ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：委内瑞拉马脑脊髓炎ＥＥＥ（ｅａｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：东方型马脑脊髓炎ＷＥＥ（ｗｅｓｔｅｒｎｅｑｕｉｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）：西方型马脑脊髓炎ＲＫ１３细胞系（ｒａｂｂｉｔｋｉｄｎｅｙ１３ｃｅｌｌｌｉｎｅ）：兔肾细胞系Ｖｅｒｏ细胞系（ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｌｉｎｅ）：非洲绿猴肾细胞系４　生物安全要求本标准的病毒分离、间接免疫荧光分型试验和蚀斑减数中和试验，均需要在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。人员需提前进行ＶＥＥ疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在１∶２０以上。５　样品采集５．１　试剂和材料采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见Ａ．１．３）、柠檬酸钠抗凝剂（配制见Ａ．１．４）。５．２　采样数量和类型采样的数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行。样品类型包括：全血、血清、脑脊液、组织［脑和（或）脊髓］。１犛犖／犜２８３３—２０１１５．３　采集方法５．３．１　血液样品无菌采集１０ｍＬ～１５ｍＬ全血，立即转至含柠檬酸钠抗凝剂（终浓度为１０％）的离心管中，低温运送。５．３．２　血清样品每头动物采集全血１０ｍＬ～１５ｍＬ，提取血清３ｍＬ以上，低温运送到实验室。５．３．３　脑脊液样品无菌采集脑脊液１ｍＬ以上，立即低温运送到实验室。５．３．４　组织样品无菌采取动物的脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温４８ｈ内运送到实验室。如果４８ｈ内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。６　病原分离鉴定６．１　病毒分离６．１．１　设备和器材低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥３０００犵）、生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（１．０ｍＬ～１０ｍＬ）及配套枪头。６．１．２　试剂和材料６．１．２．１　ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞。６．１．２．２　ＭＥＭ培养基。６．１．２．３　３日龄～５日龄乳鼠。６．１．２．４　６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚。６．１．２．５　胎牛血清（无ＢＶＤＶ抗体及其他牛病抗体）。６．１．２．６　样品缓冲液，配制见Ａ．１．３。６．１．２．７　细胞生长液和维持液，配制见Ａ．２．１。６．１．２．８　ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．１．３　操作方法６．１．３．１　样品制备组织样品低温均质后，加入样品缓冲液制成１０％悬液，１５００犵，４℃离心２０ｍｉｎ。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。６．１．３．２　细胞分离试验用适量ＡＴＶ缓冲液，将培养的ＲＫ１３细胞和（或）Ｖｅｒｏ细胞传代。待细胞长至８０％～１００％，每瓶细胞按１０％体积加入样品悬液，３７℃感作１ｈ～２ｈ后加入细胞维持液，３７℃培养６ｄ～８ｄ，逐日观察２犛犖／犜２８３３—２０１１细胞病变。每份样品接种ＲＫ１３和（或）Ｖｅｒｏ细胞各２瓶，同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变，则将细胞反复冻融３次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现７０％～９０％细胞病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行间接免疫荧光分型试验鉴定。６．１．３．３　鸡胚分离每份样品接种２枚～４枚６日龄～８日龄ＳＰＦ鸡胚卵黄囊，每枚０．５ｍＬ，孵化７ｄ。弃２４ｈ内死亡鸡胚，收集２４ｈ后死亡的鸡胚，用间接免疫荧光分型试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代。６．１．４　结果判定６．１．４．１　细胞分离试验细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变则判定为阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行间接免疫荧光分型试验。６．１．４．２　鸡胚分离试验若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行间接免疫荧光分型试验。６．２　间接免疫荧光分型试验６．２．１　设备和器材生物安全柜（ＣｌａｓｓⅡ以上）、二氧化碳培养箱（３７℃±２℃）、超低温冰箱、荧光显微镜、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管和移液器等。６．２．２　试剂和材料６．２．２．１　丙酮（－７０℃预冷）。６．２．２．２　Ｖｅｒｏ细胞。６．２．２．３　ＭＥＭ培养基。６．２．２．４　ＶＥＥＶ病毒储液。６．２．２．５　胎牛血清（无ＢＶＤＶ及其他牛病病毒抗体）。６．２．２．６　正常小鼠腹水，用无菌ＰＢＳ稀释到１∶１６０。６．２．２．７　多价ＶＥＥ抗体，由指定单位提供。６．２．２．８　ＦＩＴＣ标记的抗小鼠抗体，使用商品说明书推荐的稀释度或预试验确定。６．２．２．９　ＶＥＥ单克隆抗体：１Ａ３Ａ５（１ＡＢ，１Ｃ特异性）；１Ａ１Ｂ９（１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ特异性）；１Ａ６Ｃ３（１ＡＢ特异性）；３Ｂ４Ｃ４（１ＡＢ，１Ｃ，１Ｄ特异性）。６．２．２．１０　细胞生长液和细胞维持液，配制见Ａ．２．１。６．２．２．１１　ＡＴＶ缓冲液，配制见Ａ．２．２。６．２．２．１２　ＰＢＳ溶液，配制见Ａ．３．１。６．２．２．１３　封固溶液，配制见Ａ．３．２。６．２．３　操作步骤６．２．３．１　细胞准备试验前１ｄ～２ｄ，将Ｖｅｒｏ细胞用ＡＴＶ缓冲液消化传代到Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，３７℃、５％二氧化碳培养。待细胞长至８０％～１００％，移去管内的培养液，换成细胞维持液。对于每一个分离株的鉴定，需准３犛犖／犜２８３３—２０１１备３６支Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管。６．２．３．２　固定和预染色６．２．３．２．１　用无血清ＭＥＭ培养基将分离株从１０－２到１０－５梯度稀释。每个梯度样品接种６支～８支Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管，０．１ｍＬ／管。取６支作正常细胞对照，用ＭＥＭ（１×，ｐＨ７．２）稀释各种亚型的ＶＥＥ病毒储液到１００ＴＣＩＤ５０～１０００ＴＣＩＤ５０后，接种Ｌｅｉｇｈｔｏｎ试管作阳性对照。３７℃、５％二氧化碳培养１８ｈ后，从每个稀释度各取１块玻片用丙酮固定，５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。６．２．３．２．２　用多价ＶＥＥ抗体做一抗，３７℃湿盒孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。ＰＢＳ润洗一次后，在新鲜ＰＢＳ中浸泡５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，双蒸水中润洗一次，置于玻片架上，细胞面向上。６．２．３．２．３　用ＦＩＴＣ标记的抗小鼠抗体做二抗，３７℃湿盒中孵育２５ｍｉｎ～４５ｍｉｎ。同前洗涤，空气中干燥，用荧光显微镜观察结果。若病毒生长量不足，再培养４ｈ～６ｈ或更长。确定出最佳感染效果后，将余下的坡片固定备用。固定好的玻片置于密闭的盒子中，－７０℃保存备用。６．２．３．２．４　组织冰冻切片（８μｍ），丙酮固定５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；组织涂片空气中干燥３０ｍｉｎ，丙酮固定。将固定好的片子密闭保存于－７０℃备用。６．２．３．３　染色用ＶＥＥ多价抗体、１Ａ３Ａ５，１Ａ１Ｂ９，１Ａ６Ｃ３，３Ｂ４Ｃ４和正常小鼠腹水做一抗，ＦＩＴＣ标记抗小鼠抗体做二抗，进行ＩＦＡ染色，方法同６．２．３．２．２和６．２．３．２．３。同时对阳性对照和正常细胞对照进行染色。６．２．４　结果判定若阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无任何特异性荧光，且正常小鼠腹水做一抗的玻片无特异性荧光，则试验成立。将待检样品获得的试验结果和ＩＦＡ分型鉴定表（见表１）进行比较，确定感染的类型。表１　犐犉犃分型鉴定表亚型ＶＥＥ多价抗体１Ａ３Ａ５１Ａ１Ｂ９１Ａ６Ｃ３３Ｂ４Ｃ４正常小鼠腹水１ＡＢ＋＋－＋＋－１Ｃ＋＋－－＋－１Ｄ＋－＋－＋－１Ｅ，１Ｆ＋－＋－－－正常培养细胞－－－－－－　　注：“＋”代表有荧光，用“－”代表无荧光。７　血清学检测７．１　血凝抑制试验７．１．１　设备和器材Ｕ型血凝板、冷冻离心机（≥３０００犵）、温箱（３７℃±２℃）、移液器（８孔道和单孔道）及配套枪头。４犛犖／犜２８３３—２０１１７．１．２　试剂和材料７．１．２．１　阳性血清（指定单拉提供）。７．１．２．２　阴性血清（指定单位提供）。７．１．２．３　抗原（指定单位提供）。７．１．２．４　２５％白陶土溶液（用硼酸盐缓冲液配制）。７．１．２．５　硼酸盐缓冲液（ｐＨ９．０），配制见Ａ．４．１。７．１．２．６　ＤＧＶ缓冲液，配制见Ａ．４．２。７．１．２．７　红细胞：采集公鹅血，用ＤＧＶ缓冲液洗涤３次，重悬于ＤＧＶ缓冲液中成７％悬液。存放于４℃备用。临用前用硼酸盐缓冲液１∶２４稀释。７．１．２．８　待检血清：５６℃灭活３０ｍｉｎ，取０．１ｍＬ待检血清加０．４ｍＬ２５％白陶土溶液，混匀，置于３７℃作用３０ｍｉｎ，３０００犵离心５ｍｉｎ，取上清液备用。７．１．３　操作方法７．１．３．１　犎犃试验将抗原用硼酸盐缓冲液作１０倍稀释，４℃放置１ｈ。在血凝板的第１孔～第１２孔加入０．０５ｍＬ硼酸盐缓冲液；吸取０．０５ｍＬ稀释后的抗原加入第１孔，混匀；从第一孔吸取０．０５ｍＬ混匀后的抗原加入第２孔，混匀后吸取０．０５ｍＬ至第３孔，依次倍比稀释至第１１孔。从第１１孔吸取０．０５ｍＬ弃之。每孔加入０．０５ｍＬ工作浓度的公鹅红细胞，室温孵育４５ｍｉｎ～６０ｍｉｎ后观察结果。以红细胞发生完全凝集的最高稀释度作为病毒抗原的１个血凝素单位（１ＨＡ）。配制８单位抗原用于ＨＩ试验。７．１．３．２　犎犐试验ＨＩ试验程序见表２。除第１孔外，血凝板的第２孔～第１０孔，每孔加入０．０２５ｍＬ硼酸盐缓冲液。第１孔和第２孔各加入０．０２５ｍＬ血清样品，混匀后从第２孔吸取０．０２５ｍＬ血清加入第３孔，依次倍比稀释至第８孔，混匀后从第８孔吸取０．０２５ｍＬ，弃去。第９孔和第１０孔不加血清，第９孔为血凝素对照，第１０孔为稀释液对照。除第１０孔外，每孔加入８单位抗原０．０２５ｍＬ，４℃，过夜（或２２℃～２４℃，反应１ｈ）。每孔加入０．０５ｍＬ工作浓度的鹅红细胞悬液，３７℃，３０ｍｉｎ后判定结果。每次试验设立阳性和阴性血清对照。表２　犎犐试验程序单位为毫升孔号１２３４５６７８９１０稀释梯度１／５１／１０１／２０１／４０１／８０１／１６０１／３２０１／６４０血凝素对照稀释液对照硼酸盐稀释液血清　０．０２５　　０．０２５０．０２５烍烌烎　０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎０．０２５０．０２５烍烌烎→０．０２５０．０２５　　　０．０２５　　　０．０５８单位抗原０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５０．０２５４℃，过夜（或２２℃～２４℃，反应１ｈ）红