SNT 2801-2011 传染性念球菌病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８０１—２０１１传染性念珠菌病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犮犪狀犱犻犱犻犪狊犻狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国沈阳出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局和中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林颖、廉慧锋、刘金华、耿庆华、王金玲、王芳、贾琳、巩红霞、张敏爱。Ⅰ犛犖／犜２８０１—２０１１传染性念珠菌病检疫技术规范１　范围本标准规定了传染性念珠菌分离培养、镜检及鉴定方法。本标准适用于传染性念珠菌病的检疫和诊断。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　试剂及设备３．１　试剂３．１．１　生理盐水，实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求，配制见Ａ．１。３．１．２　１０％氢氧化钾溶液，配制见Ａ．２。３．１．３　革兰氏（Ｇｒａｍｓ）染液，配制见Ａ．３。３．１．４　葡萄糖酵母汁蛋白胨液体培养基，配制见Ａ．４。３．１．５　沙堡氏琼脂培养基（ＳＤＡ），配制见Ａ．５。３．１．６　动物（兔、豚鼠、鸡、牛、羊等均可）血清。３．１．７　１％玉米粉吐温８０琼脂平板，配制见Ａ．６。３．１．８　科玛嘉显色培养基（ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭＣａｎｄｉｄａ显色培养基）１）。１）　ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭＣａｎｄｉｄａ显色培养基是由ＣＨＲＯＭａｇａｒ公司提供的产品商品名，给出这一信息是为了方便本部分的使用者。如果其他等效产品具有相同或更佳效果，则可使用那些等效产品。但应注意：在ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭＣａｎｄｉｄａ显色培养基上，白色念珠菌呈绿色。检测时，应注意可疑菌落的挑选，以避免漏检。２）　ＡＰＩ犆犪狀犱犻犱犪假丝酵母鉴定条是由生物梅里埃公司提供的产品商品名，给出这一信息是为了方便本部分的使用者。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用那些等效产品。３．１．９　ＡＰＩ犆犪狀犱犻犱犪假丝酵母鉴定系统２）。３．２　设备３．２．１　电热鼓风干燥箱。３．２．２　高压灭菌锅。３．２．３　生化培养箱：２５．０℃±１℃，３６．０℃±１℃。３．２．４　低温高速离心机（转速３０００ｒ／ｍｉｎ以上）。３．２．５　生物显微镜。１犛犖／犜２８０１—２０１１４　诊断方法４．１　涂片镜检法４．１．１　样品采集采集口腔、咽喉、食道和嗉囊发生的白色假膜和溃疡物，血、尿、粪便及脏器组织。血、尿等液体样品需经３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ后取沉淀物作涂片外，其他样品均可用生理盐水或１０％氢氧化钾涂片后直接镜检或革兰氏染色后镜检。４．１．２　生理盐水或１０％氢氧化钾涂片镜检在载玻片上加１滴生理盐水或１０％氢氧化钾溶液，将待检样品与生理盐水或１０％氢氧化钾溶液混合作涂片，加盖玻片后置显微镜下观察。在涂片中可见到孢子呈卵圆形成群或成链状排列，大小约为２μｍ×６μｍ，有时见假菌丝。４．１．３　革兰氏（犌狉犪犿狊）染色涂片经火焰固定后，滴加草酸胺结晶紫液数滴，染色１ｍｉｎ，水洗。滴加革兰氏碘液媒染１ｍｉｎ，水洗。滴加９５％酒精脱色，不断轻摇玻片，３ｓ～５ｓ后，斜持玻片，使酒精流去，再滴９５％酒精，如此反复２次～３次至无紫色脱落为止。水洗滴加复红染液１ｍｉｎ，水洗、干燥、镜检。在涂片中可见到革兰氏阳性的芽生孢子及菌丝或假菌丝。４．２　分离培养镜检４．２．１　葡萄糖酵母汁蛋白胨液体培养基培养样品接种葡萄糖酵母汁蛋白胨液体培养基后，经２５℃３ｄ培养，培养基表面无薄膜，多在管底生长。镜下可见孢子呈球形或短卵圆形，大小为（３．５μｍ～６μｍ）×（６μｍ～１１μｍ）。４．２．２　沙堡罗氏琼脂培养基（犛犇犃）培养样品接种沙堡罗氏琼脂培养基，３７℃或室温均可生长。培养２４ｈ～４８ｈ后，可形成白色乳脂状高度隆凸的菌落，光滑、柔软而闪亮，菌落具有酿酒味，老龄培养物可形成带隔膜的菌丝、球形带厚膜的肿胀细胞。４．３　鉴定试验４．３．１　芽管形成试验４．３．１．１　玻片法：首先在载玻片上滴加１滴血清，然后接种少量真菌，覆以灭菌盖玻片，置湿润的平皿内，置３７℃温箱培养，每隔１ｈ检查１次，共检查３次。４．３．１．２　试管法：取无菌小试管一支，加入０．２ｍＬ动物血清，接种少量真菌，充分振荡混合数分钟后，置３７℃生化培养箱培养，之后每隔１ｈ用铂金耳取出１滴含菌血清，放载玻片上覆以盖玻片，镜检，共检３次。白色念珠菌可由孢子长出短小的芽管。４．３．２　厚膜孢子形成试验按顺时针方向将１％吐温８０玉米粉琼脂平板等分成１２个部分，先从１０点处向２点方向用接种环在培养基深层划线培养（不超过深度三分之二），然后在４点及８点两处进行点种。分别在１０点和２点２犛犖／犜２８０１—２０１１划线处的中央和点种的４点及８点处覆以灭菌的盖玻片。轻轻按压后置２２℃～２５℃环境中培养，经２４ｈ～４８ｈ培养后显微镜下观察结果。白色念珠菌可见大量厚膜孢子。４．３．３　科玛嘉培养基显色培养将样品接种于科玛嘉显色培养基上，３６℃±１℃培养２４ｈ～４８ｈ。观察结果见表１。表１　念珠菌科玛嘉显色培养基培养结果菌　　种显　　　　色直　　径ｍｍ白色念珠菌绿色、翠绿色约２热带念珠菌蓝灰色、铁蓝色约１．５克柔氏念珠菌粉红色（模糊、有微毛、菌落极大）４～５光滑念珠菌紫色２其他念珠菌白色—４．３．４　生化反应将培养物通过ＡＰＩ犆犪狀犱犻犱犪假丝酵母菌鉴定系统进行鉴定，鉴定结果见表２。表２　念珠菌生化反应结果菌　　种葡萄糖麦芽糖蔗糖乳糖发酵性同化性发酵性同化性发酵性同化性发酵性同化性白色念珠菌ＡＧ＋ＡＧ＋Ａ＋——热带念珠菌ＡＧ＋ＡＧ＋ＡＧ＋——伪热带念珠菌ＡＧ＋——ＡＧ＋ＡＧ＋克柔氏念珠菌ＡＧ＋——————光滑念珠菌ＡＧ＋——————类星形念珠菌ＡＧ＋ＡＧ＋————季也蒙氏念珠菌ＡＧ（迟）＋Ａ／—＋ＡＧ（迟）＋——近平滑念珠菌ＡＧ＋—＋—＋——　　注：Ａ———产酸；ＡＧ———产酸产气；＋———同化；————阴性。３犛犖／犜２８０１—２０１１附　录　犃（规范性附录）试剂配制犃．１　生理盐水ＮａＣｌ　　　　　　　　８．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ两者混合后，经１２１℃１５ｍｉｎ高压灭菌后即成。犃．２　１０％氢氧化钠溶液ＫＯＨ　　　　　　　　１００．０ｇ生理盐水１０００ｍＬ两者混合即可。犃．３　革兰氏（犌狉犪犿狊）染液犃．３．１　结晶紫染液甲液结晶紫　　　　　　　２．０ｇ９５％酒精２０ｍＬ乙液草酸胺０．８ｇ蒸馏水８０ｍＬ用时将甲液稀释５倍，加２０ｍＬ于乙液８０ｍＬ，混合即成。犃．３．２　革兰氏碘液碘片１．０ｇ碘化钾２．０ｇ蒸馏水３００ｍＬ将碘与碘化钾混合，加入少量蒸馏水，完全溶解后，再补水至３００ｍＬ。犃．３．３　脱色剂９５％酒精犃．３．４　复红染液２．５％复红酒精溶液１０ｍＬ蒸馏水９０ｍＬ混合即成。４犛犖／犜２８０１—２０１１犃．４　葡萄糖酵母汁蛋白胨液体培养基酵母膏５．０ｇ蛋白胨１０．０ｇ葡萄糖２０．０ｇ加水至１０００ｍＬｐＨ６．０～６．５于１１５℃湿热灭菌３０ｍｉｎ。犃．５　沙堡罗氏琼脂培养基蛋白胨１０．０ｇ葡萄糖４０．０ｇ琼脂粉１３．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ加热溶解分装三角烧瓶。经１２１℃１５ｍｉｎ灭菌倾注平皿备用。犃．６　１％吐温８０玉米粉琼脂玉米粉琼脂１８．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ吐温８０１０ｍＬ将玉米粉琼脂加入蒸馏水中加热溶解后，再加入吐温８０，分装三角烧瓶中，经１２１℃１５ｍｉｎ灭菌备用。５犛犖／犜２８０１—２０１１书书书１１０２—１０８２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准传染性念珠菌病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８０１—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．７５　字数１１千字２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２０１１　定价１６．００元