SNT 1586.3-2011 菜豆的多重PCR鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１５８６．３—２０１１菜豆的多重犘犆犚鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊犫狔犿狌犾狋犻狆犾犲犘犆犚２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ１５８６系列标准共分为三部分：———第１部分：菜豆细菌性萎蔫病菌检测方法；———第２部分：菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法；———第３部分：菜豆的多重ＰＣＲ鉴定方法。本部分为ＳＮ／Ｔ１５８６的第３部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人：许瑾、徐涛、梁成珠、岳志芹、郑小龙、吴志毅、张舒亚、陈洪俊。Ⅰ犛犖／犜１５８６．３—２０１１菜豆的多重犘犆犚鉴定方法１　范围ＳＮ／Ｔ１５８６的本部分规定了对菜豆遗传种质资源多重ＰＣＲ鉴定方法。本部分适用于菜豆物种及其遗传材料的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＡＳＴＭＥ１３４２　用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌、原生生物、病毒、遗传要素以及动物和植物组织的标准实施规范３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１荚果　犾犲犵狌犿犲豆科植物特有的果实。由单个心皮发育而成的果实。一室内含２个或２个以上的种子，成熟后果皮沿两侧自下而上裂开。３．２子房　狅狏犪狉狔被子植物生长种子的器官，位于花的雌蕊下面，一般略为膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以发育为种子。是被子植物花中雌蕊的主要组成部分，子房由于房壁和胚珠组成。当传粉受精后，子房发育成果实。子房壁最后发育成果皮，包裹种子，有的种类形成果肉，如桃、苹果等。３．３花萼　犮犪犾狔狓位于花冠外面的绿色被片，它在花朵尚未开放时，起着保护花蕾的作用。是一朵花中所有萼片（ｓｅｐａｌ）的总称，包被在花的最外层。萼片多为绿色而相对较厚的叶状体。萼片彼此分离的叫离萼，萼片彼此合生的叫合萼，合萼下端称萼筒，上端分离部分称萼裂片；两轮萼裂片的外轮称副萼。３．４　萼齿　犮犪犾狔狓狋狅狅狋犺合生萼片的分离部分。３．５花冠　犮犺犪狆犾犲狋一朵花中所有花瓣的总称，位于花萼的内侧。３．６花柱　狊狋狔犾犲雌蕊中连接柱头与子房的部分。一般为细长管状，也有极短的，如水稻、小麦。花柱是花粉进入子１犛犖／犜１５８６．３—２０１１房的通道。３．７复叶　犮狅犿狆狅狌狀犱犾犲犪犳两至多枚分离的小叶，共同着生在一个叶柄上，称为复叶。４　原理菜豆植物资源进出境时，可能存在的形态有：种子、幼苗、植株、叶片、花序、花粉、组培苗、原生质体、组织、细胞、核酸等。以多重ＰＣＲ方法为主，并借助形态学特征是制订本标准的主要依据。５　仪器设备和用具５．１　ＰＣＲ扩增仪。５．２　电泳仪。５．３　凝胶成像仪。５．４　核酸蛋白分析仪。５．５　离心机。５．６　水浴锅。５．７　植物光照培养箱。５．８　低温冰箱。５．９　冷冻冷藏冰箱。５．１０　电子天平。５．１１　水浴锅。５．１２　小型粉碎装置。５．１３　涡旋振荡器。５．１４　可调移液器（１０００μＬ、２００μＬ、１００μＬ、２０μＬ、１０μＬ、２．５μＬ）、可调移液器头、离心管、研钵等。６　试剂及溶液６．１　样品提取缓冲液：１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５），１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钠，５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），２％ＳＤＳ。６．２　试验用水：按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定。６．３　ＲＮＡ消化酶。６．４　ＥＤＴＡ（０．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０）：在８００ｍＬ水中加入１８６．１ｇＥＤＴＡＮａ２·２Ｈ２Ｏ，用磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液ｐＨ值至８．０（约需２０ｇ氢氧化钠颗粒），然后加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌备用。６．５　１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液（ｐＨ８．０）：称取１２１．１ｇＴｒｉｓ，溶于８００ｍＬ水中，加入浓盐酸４２ｍＬ，冷却至室温，用稀盐酸准确调节ｐＨ至８．０，加水定容至１Ｌ，分装后高压灭菌备用。６．６　ＴＥ（ｐＨ８．０）：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。６．７　１０×Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（电泳上样缓冲液）。６．８　ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。６．９　琼脂糖。６．１０　植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒。２犛犖／犜１５８６．３—２０１１６．１１　Ｔｒｉｓ饱和苯酚、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、乙醇等有机溶剂，有机试剂如未有特殊说明，均为分析纯。６．１２　ＰＣＲ试剂盒（包括１０×ＰＣＲ缓冲液、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ）。６．１３　犜犪狇酶。６．１４　引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）。７　鉴定方法７．１　形态特征参见附录Ａ。７．２　多重犘犆犚法７．２．１　基因组犇犖犃提取取２ｇ～３ｇ新鲜幼苗或叶片放入研钵，加入液氮迅速研磨，然后将粉末装入１．５ｍＬ离心管中（约占三分之一管）；加入６５℃预热的样品提取缓冲液６５０μＬ充分混匀后，将离心管放入６５℃水浴锅中温浴２ｈ，其间轻摇数次；８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液入另一１．５ｍＬ离心管，加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇（２５∶２４∶１），轻摇１５ｍｉｎ，４℃离心１０ｍｉｎ（８０００ｒ／ｍｉｎ）；取上清液６００μＬ转移至另一１．５ｍＬ离心管中，加入等体积三氯甲烷，轻柔混匀后，４℃离心１０ｍｉｎ（８０００ｒ／ｍｉｎ）；将上清液转移至另一离心管内，加入三分之二体积预冷的异丙醇，－２０℃放置３０ｍｉｎ，４℃离心２５ｍｉｎ（３５００ｒ／ｍｉｎ～４０００ｒ／ｍｉｎ），用灭菌牙签小心挑出絮状沉淀转入另一管中用７０％乙醇洗涤两次；弃上清液，干燥约３０ｍｉｎ后溶于２００μＬ１×ＴＥ中；加入２μＬＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）于３７℃消化２ｈ；加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇（２５∶２４∶１）轻轻混匀于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；将上清液转移到另一离心管中，加入等体积三氯甲烷，轻柔混匀后４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；将上清液转移到另一离心管中，加入１／１０体积的３ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠（ｐＨ５．２），混匀后加入２倍体积预冷的无水乙醇；轻轻混匀，放置在－２０℃３０ｍｉｎ，４℃离心２５ｍｉｎ（３５００ｒ／ｍｉｎ～４０００ｒ／ｍｉｎ），挑出沉淀用７０％乙醇洗涤两次干燥后加入１００μＬ１×ＴＥ溶解。对于种子样品的模板ＤＮＡ提取：选取３粒～５粒饱满种子，放入研钵，加入液氮迅速研磨，然后将粉末装入１．５ｍＬ离心管中，加入１ｍＬＣＴＡＢ裂解液（含适量ＲＮＡ酶），混匀，６０℃水浴振荡保温１ｈ；２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；取上清液，加等体积三氯甲烷／异戊醇（体积比：２４／１）混匀，静置５ｍｉｎ８０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ；取上清液，加０．６５倍体积的异丙醇，混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ；弃上清液，加５００μＬ７０％冰乙醇洗涤一次，１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心５ｍｉｎ；弃上清液，将沉淀晾干，加入５０μＬ１×ＴＥ溶解。也可用相应市售ＤＮＡ提取试剂盒提取模板ＤＮＡ。７．２．２　犇犖犃质量检查及测定１．０％琼脂糖胶电泳检测或用紫外分光光度计测定，若用紫外分光光度计测定，可根据公式：ＤＮＡ纯度＝ＯＤ２６０／ＯＤ２８０（比值在１．７～１．９范围内为ＰＣＲ级）；ＤＮＡ浓度（μｇ／ｍＬ）＝５０×ＯＤ２６０，测定核酸的纯度和浓度后，将ＤＮＡ保存在－２０℃，备用。７．２．３　多重犘犆犚扩增反应７．２．３．１　引物菜豆多重ＰＣＲ扩增引物见表１。３犛犖／犜１５８６．３—２０１１表１　引物序列名　　称序　　列扩增片段ｂｐ备　　注狋狉狀犔５’ｃｇａａａｔｃｇｇｔａｇａｃｇｃｔａｃｇ３’５’ｃｇａａａｔｃｇｇｔａｇａｃｇｃｔａｃｇ３’５００～６００绿色植物通用引物ｐｔＣＤ５’ｔａａｃａａａａｃｇａａａｔｔｇａｃｇ３’５’ｔｃｃｇａｔｔａｔｇａｔａａａｇｔｇａａ３’１７０菜豆特异引物７．２．３．２　反应体系反应体系见表２。表２　反应体系试剂名称储备液浓度２０μＬ反应体系加样体积μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液（不含Ｍｇ２＋）２．０氯化镁溶液２５ｍｍｏｌ／Ｌ１．６ｄＮＴＰ１０ｍｍｏｌ／Ｌ３．２引物狋狉狀犔１０ｍｍｏｌ／Ｌ各０．４引物ｐｔＣＤ１０ｍｍｏｌ／Ｌ各０．８犜犪狇酶５Ｕ／μＬ０．４ＤＮＡ模板５０ｎｇ／μＬ１双蒸水补至２０μＬ７．２．３．３　反应条件预变性９４℃５ｍｉｎ，再经９４℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，循环３０次，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。７．２．３．４　实验对照的设立每个样品应有两个平行实验，同时每次检测应设立３个对照：———阳性对照，为已知是菜豆的ＤＮＡ或含有待测基因序列的质粒；———阴性对照，非菜豆基因组ＤＮＡ；———空白对照，以水代替ＤＮＡ模板。７．２．４　犘犆犚扩增产物的凝胶电泳检测将ＴＡＥ和电泳级琼脂糖按２．０％（质量浓度）配好，加入ＳＹＢＲ?ＧｒｅｅｎⅠ核酸染料终浓度为０．５μｇ／ｍＬ，混匀，制胶。用适量的（约２μＬ～３μＬ）６×加样缓冲液分别与１０μＬ样品混合，然后将其和适合的ＤＮＡ分子量标准物分别加入到样品孔中，电泳（电压１００Ｖ～１２０Ｖ）。结束时将胶置于凝胶成像仪上观察。４犛犖／犜１５８６．３—２０１１８　结果判定符合附录Ａ描述的判为菜豆。通过成像观察，若分别有５００ｂｐ～６００ｂｐ和１７０ｂｐ大小的两条产物带出现，即可判定为阳性（检测样品为菜豆）；仅出现５００ｂｐ～６００ｂｐ的带（为菜豆以外的其他植物）或无任何扩增带出现（非绿色植物），判定为阴性。９　样品保存与复核９．１　样品保存物种资源的样品保存方法按照ＡＳＴＭＥ１３４２执行。９．２　结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的名称与编号、来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。检测需有最终的实验数据、电泳结果照片等。原始数据应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。９．３　复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。５犛犖／犜１５８６．３—２０１１附　录　犃（资料性附录）菜豆的相关资料犃．１　分类地位菜豆学名为犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊Ｌｉｎｎ．，中文别名：云藊豆、四季豆、芸豆、玉豆等。隶属被子植物门（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ），双子叶植物纲（Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ），豆目（Ｆａｂａｌｅｓ），豆科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ），菜豆属（犘犺犪狊犲狅犾狌狊Ｌｉｎｎ．）。犃．２　生物学特性一年生、缠绕或近直立草本。茎被短柔毛或老时无毛。羽状复叶具３小叶；托叶披针形，长约４ｍｍ，基着。小叶宽卵形或卵状菱形，侧生的偏斜，长４ｃｍ～１６ｃｍ，宽２．５ｃｍ～１１ｃｍ，先端长渐尖，有细尖，基部圆形或宽楔形，全缘，被短柔毛。总状花序比叶短，有数朵生于花序顶部的花；花梗长５ｍｍ～８ｍｍ；小苞片卵形，有数条隆起的脉，约与花萼等长或稍长，宿存；花萼杯状，长３ｍｍ～４ｍｍ，上方的２枚裂片连合成一微凹的裂片；花冠白色、黄色、紫堇色或红色；旗瓣近方形，宽９ｍｍ～１２ｍｍ，翼瓣倒卵形，龙骨瓣长约１ｃｍ，先端旋卷，子房被短柔毛，花柱压扁。荚果带形，稍弯曲，长１０ｃｍ～１５ｃｍ，宽１ｃｍ～１．５ｃｍ，略肿胀，通常无毛，顶有喙；种子４个～６个，长椭圆形或肾形，长０．９ｃｍ～２ｃｍ，宽０．３ｃｍ～１．２ｃｍ，白色、褐色、蓝色或有花斑，种脐通常白色。花期春夏。犃．３　分布范围全国均有栽培。原产美洲，现广植于各热带至温带地区。犃．４　菜豆属分种检索表１．小苞片显著，通常与花萼等长或稍较长；宿存。２．花序较叶为短；荚果带形，稍弯曲，顶端不变宽１．菜豆　犘．狏狌犾犵犪狉犻狊Ｌｉｎｎ．………