SNT 1151.4-2011 虾黄头病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５１．４—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５１．４—２００３虾黄头病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊犺狉犻犿狆狔犲犾犾狅狑犺犲犪犱犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准虾黄头病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１５１．４—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．７５　字数１７千字２０１１年１１月第一版　２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８５　定价１６．００元书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ１１５１系列标准共分为６部分：———虾桃拉综合征检疫技术规范；———对虾白斑病检疫技术规范；———斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）诊断方法；———虾黄头病检疫技术规范；———对虾杆状病毒（ＢＰ）检验方法；———对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。本部分为ＳＮ／Ｔ１１５１的第４部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１５１．４—２００３《对虾黄头病毒（ＹＨＶ）逆转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）检测方法》。本部分与ＳＮ／Ｔ１１５１．４相比，主要技术变化如下：———新增套式ＲＴＰＣＲ鉴别诊断方法；———新增ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测方法。本部分修改采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）第２．２．７章。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：熊炜、蒋静、张强、刘荭、李健、王巧全、邱璐、黄忠荣、胡永强。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５１．４—２００３。Ⅰ犛犖／犜１１５１．４—２０１１虾黄头病检疫技术规范１　范围ＳＮ／Ｔ１１５１的本部分规定了虾黄头病ＲＴＰＣＲ和ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测的操作方法。本部分适用于虾黄头病流行病学调查、诊断、检疫和监测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样３　概述虾黄头病（Ｙｅｌｌｏｗｈｅａｄｄｉｓｅａｓｅ，ＹＨＤ）是一种由虾黄头病毒（Ｙｅｌｌｏｗｈｅａｄｖｉｒｕｓ，ＹＨＶ）引起的严重威胁虾养殖的疫病，其感染广泛、致死率高，是世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定的需上报的水生动物疫病。目前仅有斑节对虾和南美白对虾大规模爆发ＹＨＤ疫情的报道，但日本对虾、白对虾、南极磷虾等也能自然感染ＹＨＶ。ＹＨＶ属于黄头症候群病毒（Ｙｅｌｌｏｗｈｅａｄｃｏｍｐｌｅｘｏｆｖｉｒｕｓｅｓ），目前该群病毒有６个已知的基因型，ＹＨＶ（基因１型）是其中的一个型，并且是黄头病的唯一病原。鳃联病毒（Ｇｉｌｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＧＡＶ）属于基因２型。ＧＡＶ和其他几个型（基因３型～６型）在东非、亚洲和澳大利亚的健康斑节对虾中比较常见，但很少引发疾病。ＹＨＶ为有囊膜的杆状病毒，其基因组为单正链ＲＮＡ。４　试剂和材料４．１　犜犪狇酶及１０倍犜犪狇酶反应缓冲液：犜犪狇酶浓度为５Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．２　逆转录酶及１０倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为５０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．３　ＲＮＡ酶抑制剂（４０Ｕ／μＬ）：－２０℃保存，避免反复冻融。４．４　ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．５　ＲＴＰＣＲ引物：浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ，其序列如下：引物（１０Ｆ）：５’ＣＣＧＣＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＧ３’；引物（１４４Ｒ）：５’ＡＡＧＧＴＧＴＴＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＴ３’；引物（ＧＹ１）：５’ＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣＡＡＣＡＴＣＴＧ３’；引物（ＧＹ２）：５’ＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＣＴＡＴＧＡ３’；引物（ＧＹ４）：５’ＧＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＡＣＧ３’；引物（ＧＹ５）：５’ＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＡＧＡＧＡＡＣＡ３’；引物（Ｙ３）：５’ＡＣＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＴ３’；引物（Ｇ６）：５’ＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＡＧＴＧＡＣＡＣＣＴＡＴ３’；引物（ＹＣＦ１ａｂ）：５’ＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣ３’和５’ＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＹＴＡＹＣＧＴＡＡＣＡＣＣＧＣ３’两种引物混合；１犛犖／犜１１５１．４—２０１１引物（ＹＣＲ１ａｂ）：５’ＴＣＴＴＣＲＣＧＴＧＴＧＡＡＣＡＣＹＴＴＣＴＴＲＧＣ３’和５’ＴＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣ３’两种引物混合；引物（ＹＣＦ２ａｂ）：５’ＣＧＣＴＴＣＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＧＹＡＴＧＣＡＣＣＡ３’和５’ＣＧＣＴＴＹＣＡＲＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡ３’；引物（ＹＣＲ２ａｂ）：５’ＲＴＣＤＧＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴ３’和５’ＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＴＡＴＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＲＴＴ３’；简并碱基为：Ｒ（ＡＧ），Ｙ（ＣＴ），Ｍ（ＡＣ），Ｋ（ＧＴ），Ｓ（ＧＣ），Ｗ（ＡＴ），Ｈ（ＡＣＴ），Ｂ（ＧＣＴ），Ｖ（ＡＧＣ），Ｄ（ＡＧＴ），Ｎ（ＡＧＣＴ）。４．６　ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ的引物和探针：引物浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ，探针浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ，其序列如下：上游引物（ＹＨＶＦ）：５’ＡＧＧＣＧＴＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＧＡＣＡＴ３’；下游引物（ＹＨＶＲ）：５’ＡＣＧＧＣＧＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴ３’；ＴａｑＭａｎ探针（ＹＨＶＰ）：５’ＴＣＧＴＣＣＣＧＧＣＡＡＴＴＧＴＧＡＴＣ３’，其５’端和３’端分别标记ＦＡＭ和ＴＡＭＲＡ。４．７　随机引物：含有９个碱基的随机序列引物，浓度为５０μｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．８　ＤＮＡ相对分子质量标准：适合检测相对分子质量大小１００ｂｐ～１０００ｂｐ间的ＤＮＡ片段，－２０℃保存。４．９　１０倍电泳上样缓冲液：４℃保存。４．１０　ＤＥＰＣ水：自配（见Ａ．１）或购买商品化试剂。４．１１　ＥＢ溶液：４℃保存（见Ａ．２）。４．１２　Ｔｒｉｚｏｌ试剂：４℃保存。４．１３　三氯甲烷：常温保存。４．１４　异丙醇：使用前预冷至－２０℃。４．１５　７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，使用前预冷至－２０℃。５　仪器与设备５．１　荧光ＰＣＲ检测仪：ＡＢＩ７７００、ＡＢＩ７５００或相同功能荧光ＰＣＲ检测仪。５．２　普通ＰＣＲ仪：ＡＢＩ９７００或相同功能普通ＰＣＲ仪。５．３　高速台式冷冻离心机：可控温至４℃、离心速度可达１３０００犵以上。６　临床症状的诊断虾在幼虾晚期以后对ＹＨＶ最易感，在虾苗早期至晚期阶段的死亡率最高。ＹＨＤ爆发时，患病虾停止摄食、集聚于池边或在水表游动，濒死虾外表发白，头胸甲因肝胰腺变黄呈现黄色，与正常虾棕色的肝胰腺相比较软，但这些症状并不是ＹＨＤ所特有的。一旦有虾出现ＹＨＤ的临床症状并开始死亡，几天内就可出现很高的死亡率（可达１００％）。处于ＹＨＶ慢性感染期的虾，几乎没有明显的体症，行为和摄食正常，但病毒在淋巴器官中保持持续感染，可能会终生带毒，可把病毒水平传播给其他易感虾。７　采样和样品前处理７．１　采样出境检疫采样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池）进行，采样数量根据ＧＢ／Ｔ１８０８８确定。采集送实验室检测的样品可以为稚虾、半成虾和成虾。采集的样品应保持鲜２犛犖／犜１１５１．４—２０１１活，０℃～４℃冷藏保存。７．２　样品前处理７．２．１　随机取５只～１０只新鲜的虾作为采样标本，采集的部位包括：虾头部的鳃丝、肝胰腺、淋巴器官或血淋巴等组织（可部分或全部采集这些组织）。对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作为样品；虾粪便直接匀浆待检。７．２．２　取鳃丝时，用灭菌过的剪刀去除头部两侧的头胸甲，露出鳃丝，然后用剪刀剪取鳃丝。７．２．３　取肝胰腺时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，露出内部的组织器官，其中深褐色的组织为肝胰腺，用剪刀剪取整块肝胰腺组织。７．２．４　取淋巴器官时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，暴露出内部的组织器官，在胃的腹侧、肝胰腺的后面，取出白色、呈二裂片状的淋巴器官。７．２．５　取血淋巴时，先用１ｍＬ医用注射器吸取５００μＬ柠檬酸盐溶液（见Ａ．３），然后使虾腹部朝上，将针头水平插入正数第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处，然后缓慢吸取血淋巴。７．２．６　将采集的样品，按每克样品加入１ｍＬＴＮ缓冲液（见Ａ．４），然后用玻璃匀浆器将样品匀浆。将匀浆液转移至１．５ｍＬ离心管中，４℃２０００犵离心５ｍｉｎ，吸取上清液备用。７．３　阳性对照样品和阴性对照样品的处理鲜活阳性对照样品和阴性对照样品的采样和样品前处理同待检样品，将鲜活样品中取出的组织样品分装后于－７０℃超低温冰箱保存备用。实验前将冷冻组织样品取出，然后按７．２．６进行样品前处理。８　犚犖犃抽提分别取１００μＬ待检样品匀浆上清液，以及ＹＨＶ阳性样品和阴性样品的上清液，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ试剂，用枪头充分吹打２０次～３０次；加入２００μＬ三氯甲烷，涡旋振荡３０ｓ，混匀；１３０００犵离心１５ｍｉｎ；取上层水相，加５００μＬ异丙醇，上下颠倒数次混匀，－２０℃放置２０ｍｉｎ；１３０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，沉淀用１ｍＬＤＥＰＣ水配制的７５％乙醇清洗；８０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，沉淀室温干燥１０ｍｉｎ；加３０μＬＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ沉淀。ＲＮＡ溶液应尽快用于逆转录合成ｃＤＮＡ模板。商品化ＲＮＡ提取试剂盒同样适用于本标准的ＲＮＡ抽提。９　犚犜犘犆犚检测及结果判定９．１　犚犜犘犆犚方法特异性检测犢犎犞９．１．１　逆转录制备犮犇犖犃模板取１５μＬＲＮＡ溶液，加１０倍逆转录酶浓缩缓冲液２μＬ、ｄＮＴＰ０．５μＬ、引物（１４４Ｒ）０．５μＬ、ＲＮＡ酶抑制剂１μＬ、逆转录酶１μＬ。混匀后，置ＰＣＲ仪上经４２℃４０ｍｉｎ、７０℃１０ｍｉｎ，即得ｃＤＮＡ模板。９．１．２　犘犆犚检测在０．２ｍＬＰＣＲ薄壁管或八联管中，按每个样品１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液２．５μＬ、ｄＮＴＰ０．５μＬ、犜犪狇酶０．５μＬ、ｃＤＮＡ模板５μＬ、引物（１０Ｆ、１４４Ｒ）各０．５μＬ、三蒸水１５．５μＬ配制ＰＣＲ检测体系。阳性和阴性对照样品的检测体系同样配制。混匀后，置ＰＣＲ仪上经９４℃３０ｓ、５８℃３０ｓ、７２℃３０ｓ进３犛犖／犜１１５１．４—２０１１行４０个循环；然后７２℃５ｍｉｎ；最后２５℃５ｓ。９．１．３　琼脂糖凝胶电泳用０．５倍ＴＢＥ电泳缓冲液配制浓度为１．５％的琼脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）凝胶平板，将该凝胶平板放入水平电泳槽，使缓冲液刚好没过胶面，电泳缓冲液工作浓度为０．５倍ＴＢＥ（见Ａ．５）。取９μＬ在ＰＣＲ产物加入１μＬ１０倍电泳上样缓冲液，然后加至凝胶平板的样品孔，同时设定ＤＮＡ相对分子质量标准对照。１００Ｖ电压电泳约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达凝胶平板底部时停止电泳。用凝胶成像系统观察并拍摄凝胶图像。９．１．４　检测结果判定９．１．４．１　经引物对１０Ｆ和１４４