SNT 2695-2010 杀鲑气单胞菌的检验操作规程

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６９５—２０１０杀鲑气单胞菌的检验操作规程犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犱犲狋犲犮狋犻狅狀犳狅狉犃犲狉狅犿狅狀犪狊狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参照了美国渔业协会的《鱼类某些病原的检测和鉴定程序》（ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｅｒｔａｉｎＦｉｓｈＰａｔｈｏｇｅｎｓ）２００６版中“疖疮病”（犉狌狉狌狀犮狌犾狅狊犻狊）一节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张立怀、岳志芹、陈本龙、霍蕾、王建华、侯艳梅。Ⅰ犛犖／犜２６９５—２０１０杀鲑气单胞菌的检验操作规程１　范围本标准规定了杀鲑气单胞菌的检验程序。本标准适用于进出口鱼苗、幼鱼和成鱼的检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　设备材料３．１　材料３．１．１　胰蛋白胨大豆蛋白胨琼脂（ＴＳＡ）：见附录Ａ．１实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。３．１．２　胰蛋白胨大豆蛋白胨血琼脂（ＴＳＡＢ）：见附录Ａ．２。３．１．３　脑心浸液琼脂（ＢＨＩＡ）：见附录Ａ．３。３．１．４　脑心浸液血琼脂平板（ＢＨＩＡＢ）见附录Ａ．４。３．１．５　胰蛋白胨大豆蛋白胨肉汤（ＴＳＢ）：见附录Ａ．５。３．１．６　考马斯亮蓝（ＣＢＢ）：分析纯。３．１．７　微量生化反应管。３．１．８　特异性抗血清。３．２　设备３．２．１　ＰＣＲ仪。３．２．２　电泳仪。３．２．３　凝胶成像系统。３．２．４　生化培养箱：－５℃～５０℃±１℃。３．２．５　生物安全柜。３．２．６　解剖器械。４　样品的采集４．１　无临床症状鱼，无菌采集其肾、肝、脾等。４．２　对于体表有临床症状的鱼，可以采集其病灶深处的组织。１犛犖／犜２６９５—２０１０５　细菌分离鉴定５．１　样品的接种用拭子或接种环将无菌操作采集的组织在ＴＳＡ或ＢＨＩＡ上划线。推荐接种在相应血琼脂平板ＴＳＡＢ或ＢＨＩＡＢ上，于２０℃～２５℃培养４８ｈ。从金鱼、鲤鱼等病鱼的病灶部位分离时，用拭子或接种环取样接种到ＴＳＡＢ或ＢＨＩＡＢ上，于２０℃～２５℃培养４８ｈ。为便于区分有毒力杀鲑气单胞菌的特异性菌落，可在培养基中加入０．１％的考马斯亮蓝（ＣＢＢ）。杀鲑气单胞细菌在含０．１％ＣＢＢ的ＴＳＡ或ＢＨＩＡ培养基上为深蓝、深紫色易碎的菌落，无毒力的菌株在该平板上为无色的菌落。５．２　杀鲑气单胞菌的初步判定杀鲑气单胞菌菌体为革兰氏阴性短的（０．８μｍ～１．３μｍ）×（１．３μｍ～２．０μｍ）杆菌或球杆菌，两极浓染。无运动性，色素氧化酶绝大多数阳性。大多数产生弥散性棕色色素，发酵葡萄糖。在ＴＳＡＢ或ＢＨＩＡＢ上，菌落大多数溶血。符合上述特征的细菌可初步判定为杀鲑气单胞菌。５．３　玻片凝集试验初步判定为杀鲑气单胞菌的菌株，可以用杀鲑气单胞菌的抗血清进行玻片凝集试验。在干净的载玻片上，加一滴生理盐水和一滴抗血清，取一环细菌分别在生理盐水和抗血清中混匀，３ｍｉｎ内观察是否出现凝集。如果细菌在生理盐水中不凝集，在抗血清中凝集判定为杀鲑气单胞菌血清凝集阳性。如果细菌在生理盐水中凝集，则该菌为自凝菌株，不适用本试验鉴定。５．４　细菌的犘犆犚鉴定５．４．１　引物杀鲑气单胞菌ＶａｐＡ基因扩增的参考序列参见附录Ｂ。按照表１设计引物。表１　犘犆犚引物序列靶基因引物序列号引物序列ＰＣＲ产物大小表面阵列蛋白基因（ＶａｐＡ）ＡＰ１（１０８５１１０８）ＡＰ２（１５０５１４８２）５’ＧＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣ３’５’ＣＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＣ３’４２１ｂｐ５．４．２　模板的制备对于分离的菌株，采用粗提的ＤＮＡ进行鉴定。将平板上的菌落取１接种环，加到２００μＬ的无菌去离子水中，摇匀后，在９５℃热处理５ｍｉｎ，置冰上冷却。１３０００犵离心３０ｓ，取上清液用于检测。用已知杀鲑气单胞菌菌株作阳性对照，用无菌去离子水作阴性对照。细菌ＤＮＡ的提取也可以采用等效试剂盒按说明书进行。５．４．３　犇犖犃扩增采用２０μＬ反应体系：２犛犖／犜２６９５—２０１０１０×ＰＣＲ缓冲液　　　　　　　　　　　　　　　　　　２μＬＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬｄＮＴＰ混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ引物ＡＰ１（５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ　　ＡＰ２（５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ模板ＤＮＡ２μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ灭菌去离子水７．８μＬ循环参数为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５７℃退火３０ｓ，７３℃延伸４５ｓ，３５个循环。７３℃延伸１０ｍｉｎ。５．４．４　电泳用１×ＴＡＥ电泳缓冲液配制１％的琼脂糖凝胶，加入最终浓度为１μｇ／ｍＬ的溴化乙锭。用１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ作为对照，对ＰＣＲ产物进行电泳。在凝胶成像系统上观察有无４２１ｂｐ大小的特异性条带。必要时可以对扩增的条带进行测序分析。５．４．５　结果判定阴、阳性对照成立，ＰＣＲ检测检出特异条带的样品，判为条鲑气单胞菌ＰＣＲ检测阳性。５．５　亚种确定初步判定为杀鲑气单胞菌后，可以进一步按表２进行生化试验，确定其亚种。表２　杀鲑气单胞菌不同亚种的生化特性犪生化特性犃犲狉狅犿狅狀犪狊狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪ｓｕｂｐ．狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪犪犮犺狉狅犿狅犵犲狀犲狊犿犪狊狅狌犮犻犱犪狊犿犻狋犺犻犪　吲哚－＋＋－　甲基红＋＋＋－　ＶＰ－－＋－　硫化氢产生－－＋＋　赖氨酸脱羧酶ｄｄｄ－　精氨酸双水解酶＋＋＋［－］　Ｄ葡萄糖产酸＋＋＋［＋］　Ｄ葡萄糖产气＋－＋［＋］　Ｌ阿拉伯糖产酸＋－＋　Ｄ乳糖产酸＋＋＋－　甘油产酸ｄｄｄ［－］　麦芽糖产酸＋＋＋－　Ｄ甘露醇产酸＋－＋－　蔗糖产酸－＋＋ｄ　海藻糖产酸＋＋＋－　七叶苷水解＋－＋－３犛犖／犜２６９５—２０１０表２（续）生化特性犃犲狉狅犿狅狀犪狊狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪ｓｕｂｐ．狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪犪犮犺狉狅犿狅犵犲狀犲狊犿犪狊狅狌犮犻犱犪狊犿犻狋犺犻犪　脂肪酶（玉米油）＋＋＋－　ＯＮＰＧｄｄｄ＋　棕色色素＋－－－　　注：　　＋：９０％以上菌株呈阳性反应。　　［＋］：７６％～８９％菌株呈阳性反应。　　－：９０％以上菌株呈阴性反应。　　［－］：１１％～２５％菌株呈阳性反应。　　ｄ：１１～８９菌株呈阳性反应。　　ｖ：反应不稳定。　　ａ生化试验的进行，可以参照购买的生化试剂使用说明书。应培养４８ｈ判定结果。６　结果判定６．１　分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，与特异性抗血清凝集，符合杀鲑气单胞菌特性的，报告杀鲑气单胞菌检测阳性。６．２　分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，ＰＣＲ检测为阳性的，报告杀鲑气单胞菌检测阳性。６．３　分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌，经进一步生化试验，符合杀鲑气单胞菌发生特性的，判定杀鲑气单胞菌检测阳性。６．４　未分离出细菌、所分离菌不符合杀鲑气单胞菌特性的，判定杀鲑气单胞菌检测阴性。４犛犖／犜２６９５—２０１０附　录　犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１　胰蛋白胨大豆琼脂平板（犜犛犃）的配制胰蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０ｇ大豆蛋白胨５．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ先将以上成分溶解，调好ｐＨ到７．３±０．２，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犃．２　胰蛋白胨大豆血琼脂平板（犜犛犃犅）的配制胰蛋白胨１５．０ｇ大豆蛋白胨５．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ先将以上成分溶解，调好ｐＨ到７．３±０．２，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，将灭菌后的ＴＳＡ冷却至５０℃左右时，加入终浓度为５％的马血，混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犃．３　脑心浸液琼脂平板（犅犎犐犃）的配制牛心粉８．０ｇ胰蛋白胨１８．０ｇ酵母提取物２．０ｇＤ葡萄糖１．０ｇ高铁血红素０．０５ｇ维生素Ｋ０．００５ｇ盐酸半胱氨酸０．５ｇ氯化钠５．５ｇ磷酸氢二钾２．５ｇ刃天青０．００１ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ将上述成分溶解后，１１５℃高压灭菌２０ｍｉｎ，冷却至５０℃左右时，倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。５犛犖／犜２６９５—２０１０犃．４　脑心浸液血琼脂平板（犅犎犐犃犅）的配制牛心粉８．０ｇ胰蛋白胨１８．０ｇ酵母提取物２．０ｇＤ葡萄糖１．０ｇ高铁血红素０．０５ｇ维生素Ｋ０．００５ｇ盐酸半胱氨酸０．５ｇ氯化钠５．５ｇ磷酸氢二钾２．５ｇ刃天青０．００１ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ将上述成分溶解后，１１５℃高压灭菌２０ｍｉｎ，将灭菌后的ＢＨＩＡ冷却至５０℃左右时，加入终浓度为５％的马血，混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。犃．５　胰蛋白胨大豆肉汤（犜犛犅）的配制胰蛋白胨１５．０ｇ大豆蛋白胨５．０ｇ氯化钠５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ先将以上成分溶解，调好ｐＨ为７．３±０．２，分装到试管中，８ｍＬ／管。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却后备用。如需加马血，待高压灭菌的ＴＳＢ冷却至５０℃左右时，加入终浓度为５％的马血。也可使用合格的等效成品培养基。６犛犖／犜２６９５—２０１０附　录　犅（资料性附录）杀鲑气单胞菌犞犪狆犃基因扩增的参考序列ＧＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴＡＡＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＣＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＡＧＣＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧ犛犖／犜２６９５—２０１０