SNT 2693-2010 马焦虫病检疫规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６９３—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５马焦虫病检疫规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犈狇狌犻狀犲狆犻狉狅狆犾犪狊犿狅狊犻狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５《马巴贝斯虫病检测方法：微量补体结合试验方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５相比，主要技术变化如下：———增加了马焦虫病的血液涂片镜检；———增加了间接荧光抗体试验；———增加了酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、陈本龙、柴铭骏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１５２６—２００５。Ⅰ犛犖／犜２６９３—２０１０马焦虫病检疫规范１　范围本标准规定了马焦虫病的血涂片镜检、间接荧光抗体试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等技术要求。本标准适用于马属动物的马焦虫病检疫、诊断和血清学调查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　概述参见附录Ａ。４　临床症状与病理变化参见附录Ｂ。５　被检血清样品采集５．１　采血和分离按常规方法采血和分离血清。血清应新鲜，无明显蛋白凝固、无溶血、无腐败气味。５．２　运送和保存防止血清冻结和受热，若３ｄ内不能送到实验室，应采用冷藏方法运送。血清应放至４℃冰箱内保存备用。６　实验室诊断６．１　血涂片镜检６．１．１　仪器和设备普通显微镜。６．１．２　试剂和材料６．１．２．１　姬姆萨染色液，配制方法参见附录Ｃ。１犛犖／犜２６９３—２０１０６．１．２．２　载玻片：处理方法参见附录Ｃ。６．１．３　操作步骤６．１．３．１　血涂片制备无菌采集动物血液，取５０μＬ滴于载玻片的一端约三分之一处，以一端边缘光滑的载波片为推片，将推片的一端置于血滴之前，待血液沿推片端缘扩散后，自右向左推成薄血膜。将血涂片置空气中干燥，用铅笔在载玻片的标签上编号，注明制片日期。６．１．３．２　血涂片染色将制备好的血涂片８０℃热固定５ｍｉｎ，再用５％姬姆萨染液染２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。染色后涂片用自来水冲洗３次～４次，以除去附着的染料，但不能超过５ｓ，否则样本会脱色。将血涂片空气干燥，先用低倍镜（如１０×１０）观察，再用１００倍油镜下观察红细胞内是否有马焦虫裂殖子。６．１．４　结果判定６．１．４．１　若见红细胞内的裂殖子呈梨籽形，长２μｍ～５μｍ，直径１．３μｍ～３．０μｍ；成对裂殖子两尖端连接成锐角（参见附录Ｄ），则可确诊此动物为驽巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。６．１．４．２　若见红细胞内裂殖子相对较小，长度小于２μｍ～３μｍ，呈圆形或阿米巴样；成对的裂殖子尖端不连接，常成同端异向并列；通常４个裂殖子组成四联体或马尔他十字形状（参见附录Ｄ），则可确诊此动物为马巴贝斯虫感染，判定该动物感染马焦虫病。６．１．４．３　若未见有６．１．４．１和６．１．４．２所描述特征的裂殖子，则宜借助其他试验进一步确诊。６．２　间接荧光抗体试验６．２．１　仪器和设备６．２．１．１　台式离心机。６．２．１．２　冰柜：－８０℃。６．２．１．３　磁力搅拌器。６．２．１．４　荧光显微镜。６．２．１．５　微量移液器。６．２．２　试剂和材料６．２．２．１　Ｐｕｃｋ’ｓＳａｌｉｎｅＧ溶液（ｐＨ７．２）配制方法参见附录Ｅ。６．２．２．２　山羊血清。６．２．２．３　丙酮，分析纯。６．２．２．４　阳性对照血清。６．２．２．５　阴性对照血清。６．２．２．６　０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ配制方法见附录Ｅ。６．２．２．７　ＦＩＴＣ荧光素标记的羊抗马ＩｇＧ。６．２．２．８　真空管：容积１５ｍＬ。６．２．２．９　载玻片。６．２．２．１０　粘质纸带。６．２．２．１１　锡箔纸。６．２．２．１２　干燥缸。２犛犖／犜２６９３—２０１０６．２．２．１３　染色缸。６．２．２．１４　指甲油。６．２．２．１５　一次性注射器：规格为１ｍＬ。６．２．２．１６　Ｕ型微量反应板。６．２．２．１７　湿盒。６．２．３　操作步骤６．２．３．１　抗原片制作６．２．３．１．１　当已知感染马焦虫病动物红细胞染虫率达２％～５％时，采集全血，冷藏方法送至实验室。６．２．３．１．２　将装有全血的真空管置台式离心机内４℃，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。６．２．３．１．３　向真空管中加入Ｐｕｃｋ’ｓＳａｌｉｎｅＧ溶液，用移液器轻柔地反复吹打沉积的红细胞层，至重新悬浮红细胞后，４℃，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。依此法重复两次。６．２．３．１．４　用含有１０％山羊血清的Ｐｕｃｋ’ｓＳａｌｉｎｅＧ溶液重新悬浮红细胞，使血球沉积量占血球悬浮液总量的三分之一。即如果沉积的血球量为５ｍＬ，则应加入含有１０％山羊血清的Ｐｕｃｋ’ｓＳａｌｉｎｅＧ溶１０ｍＬ。６．２．３．１．５　取８μＬ的红细胞悬浮液滴在载玻片的一末段。再拿另一载玻片，将其倾斜４５°角左右，慢慢地将红细胞液滴推向载玻片的另一段，使载玻片均匀地涂有一薄层血液，并将其置空气中晾干。即得抗原片。６．２．３．１．６　依此法制备若干抗原片，并用粘质纸带遮盖封贴涂有血液的那一侧载玻片。将若干封好的载玻片用锡箔纸包好，置－８０℃冰柜中保存备用。６．２．３．２　正式试验６．２．３．２．１　依据试验所需从－８０℃冰柜中取出若干抗原片，将抗原片放置在带有干燥剂的干燥缸中，室温放置约２０ｍｉｎ。６．２．３．２．２　小心地拿掉抗原片上封贴的粘质纸带。从－２０℃冰箱中取出丙酮，将其倒入染色缸中。将抗原片放进装有丙酮的染色缸中，固定３０ｓ。迅速取出抗原片，并用纸快速扇走抗原片上的丙酮。６．２．３．２．３　待抗原片自然干燥后，用一次性注射器取指甲油，将抗原片划成２×５个约１ｃｍ２的小方块，并置空气中约３０ｍｉｎ至晾干。６．２．３．２．４　在微量反应板中，用含有１％山羊血清的ＰＢＳ溶液将被检血清、阳性对照血清和阴性对照血清作１∶８０、１∶１６０、１∶３２０、１∶１６４、１∶１２８０稀释。６．２．３．２．５　用微量移液器取１０μＬ的稀释液滴加到抗原片上相应的小方块中，将其置湿盒中室温下感作３０ｍｉｎ。６．２．３．２．６　用预冷至４℃的ＰＢＳ约５００ｍＬ冲洗玻片后，将其放入装有４℃ＰＢＳ的染色缸中磁力搅拌洗玻片１０ｍｉｎ。倒掉染色缸中的液体，重新加入４℃ＰＢＳ，磁力搅拌洗１０ｍｉｎ，依此法共洗三遍。将玻片取出置空气中约３０ｍｉｎ晾干。６．２．３．２．７　用含有１％山羊血清的ＰＢＳ溶液将荧光素标记的羊抗马ＩｇＧ作１∶８０稀释（抗体滴度高时，可增加稀释倍数），取１０μＬ稀释液加入到各小方块中，并将其置湿盒中室温下感作３０ｍｉｎ。３犛犖／犜２６９３—２０１０６．２．３．２．８　重复６．２．３．２．６。６．２．３．２．９　将干燥好的玻片置荧光显微镜下观察。６．２．４　结果判定６．２．４．１　阳性对照的判定阳性对照血清的小方块中可见强烈的特异性荧光。６．２．４．２　阴性对照的判定阴性对照血清的小方块中未见特异性荧光。６．２．４．３　被检血清的判定当对照成立时，可进行试验结果判定。当被检血清１∶８０或更高稀释度的小方块中可见特异性荧光时，则该被检血清判定为间接荧光抗体阳性。当被检血清的小方块中未见有特异性荧光时，则该被检血清判定为间接荧光抗体阴性。６．３　补体结合试验６．３．１　仪器和设备６．３．１．１　可调微量移液器。６．３．１．２　可调连续加样器。６．３．１．３　水平转子离心机。６．３．１．４　酶标仪。６．３．１．５　水浴箱。６．３．２　试剂和材料６．３．２．１　蒸馏水：ＧＢ／Ｔ６６８２中的三级水。６．３．２．２　稀释液：灭菌生理盐水。６．３．２．３　阿氏液：配制方法参见附录Ｅ。６．３．２．４　补体结合抗原：按说明书使用，使用前充分摇匀。６．３．２．５　强阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。６．３．２．６　弱阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。６．３．２．７　阴性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。６．３．２．８　溶血素：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。６．３．２．９　补体：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。６．３．２．１０　绵羊全血：选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，６０ｍＬ阿氏液中加入４０ｍＬ血，混匀，４℃冰箱内保存５ｄ后备用。６．３．２．１１　玻璃试管：１０ｍｍ×７５ｍｍ，圆底，洁净。６．３．２．１２　试管架。６．３．２．１３　９６孔“Ｕ”型微量板。６．３．２．１４　９６孔平底（）微量板。４犛犖／犜２６９３—２０１０６．３．３　操作步骤６．３．３．１　预备试验６．３．３．１．１　３％绵羊红细胞悬浮液的制备６．３．３．１．１．１　绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，最后一次离心１０ｍｉｎ。６．３．３．１．１．２　取１份下沉血泥加入到２４份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬浮液。６．３．３．１．１．３　取出２５０μＬ红细胞悬浮液加入到４．７５ｍＬ蒸馏水中，使红细胞充分破解，液体清亮。６．３．３．１．１．４　取１００μＬ加入到平底微量板孔内，纵向加８个孔。６．３．３．１．１．５　用酶标仪５４０ｎｍ下读ＯＤ值，算出平均ＯＤ值，代入校正红细胞浓度见式（１）：犃＝（犅×犆）／０．１１５－犆…………………………（１）　　式中：犃———稀释液加入量；犅———平均ＯＤ值；犆———红细胞悬浮液量。６．３．３．１．１．６　取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬浮液中即得３％红细胞悬浮液。６．３．３．１．２　溶血素效价的测定６．３．３．１．２．１　稀释溶血素取０．２ｍＬ溶血素原液，加入到１９．８ｍＬ稀释液中，制成１∶１００稀释的溶血素，再按表１稀释成不同稀释倍数的溶血素。如果溶血素是由等量甘油保存，则溶血素原液所需量加倍，并相应减少稀释液量。表１　溶血素的稀释稀释倍数溶血素量／ｍＬ生理盐水／ｍＬ１／５００１／１００溶血素１．０４．０１／１０００１／１００溶血素２．０１８．０１／１５００１／１００溶血素０．５７．０１／２０００１／１００溶血素０．５９．５１／３０００１／１０００溶血素１．０２．０１／５０００１／１０００溶血素１．０４．０１／１００００１／１０００溶血素１．０９．０６．３．３．１．２．２　制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞取７个试管，每管加１．５ｍＬ３％的红细胞悬浮液，然后分别缓慢加入不同稀释倍数的溶血素１．５ｍＬ，混匀，３７℃水浴箱中感作１５ｍｉｎ。６．３．３．１．２．３　溶血素效价的确定将补体原液预稀释至１∶１５０，按表２进行测定。５犛犖／犜２６９３—２０１０表２　溶血素效价测定试管号１２３４５６７稀释液／ｍＬ１．０１．０１．０１．０１．０１．０１．０１／１５０补体／ｍＬ０．５０．５０．５０．５０．５０．５０．５不同稀释液倍数致敏红细胞／ｍＬ０．５０．５０．５０．５０．５０．５０．５溶血素稀释倍数１／５００１／１０００１／１５００１／２０００１／３０００１／５０００１／１００００感作３７℃水浴３０ｍｉｎ（每间隔５ｍｉｎ振１次）冷稀释液／ｍＬ２．０２．０２．０２．０２．０２．０２．０　　将各管用水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，取上清液１００μＬ分注平底微量板，５４０ｎｍ下读ＯＤ值。按公式（ＯＤ值×１００／０．１１５）算出各管溶血度，在普通坐标纸上以溶血素的稀释度为横坐标，溶血度为纵坐标，绘制曲线，确定出现平高线的点，比此浓度高２５％的稀释度定为溶血素的工作效价（即为１．２５倍，溶血素稀释倍数×８０％＝溶血素工作效价）（参见附录Ｆ）。６．３．３．１．３　制备致敏