SNT 2497.10-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第10部分T淋巴细胞增殖功能测定试验

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１０—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１０部分：犜淋巴细胞增殖功能测定试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１０：犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犜犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狆狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀犳狌狀犮狋犻狅狀２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１０部分。本部分修改采用《毒理学实验方法与技术》中的免疫毒理学研究方法，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、张园、熊中强、李学洋、徐斌。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１０—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１０部分：犜淋巴细胞增殖功能测定试验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验的术语和定义、试验原理、试验方法和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品对Ｔ淋巴细胞增殖功能的影响测定试验。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ１４９２４．１　实验动物　配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５　实验动物　环境及实施３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本部分。３．１．１犜淋巴细胞　犜犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲Ｔ淋巴细胞的前体在骨髓，然后迁移至胸腺并在胸腺成熟，即胸腺来源淋巴细胞，在机体中发挥细胞免疫和免疫调节等功能。３．２　缩略语下列缩略语适用于本部分。３．２．１犕犜犜噻唑蓝３（４，５二甲基噻唑２）２，５二苯基四氮唑溴盐４　试验原理Ｔ细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如刀豆蛋白Ａ）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。ＭＴＴ比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性ＭＴＴ还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在４９０ｎｍ波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，ＭＴＴ结晶形成的量与细胞数成正比。５　试验方法５．１　试验动物小鼠或大鼠，根据试验需要选择不同体重动物。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。１犛犖／犜２４９７．１０—２０１０５．２　试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。细胞培养基、小牛血清、刀豆蛋白Ａ、ＭＴＴ（５μｇ／ｍＬ）、二甲基亚砜。５．３　主要仪器设备超净工作台、ＣＯ２培养箱、酶联免疫监测仪。５．４　试验步骤５．４．１　细胞悬液制备无菌获取不同来源淋巴细胞（脾、胸腺、外周血等），用含１０％小牛血清的细胞培养基制成细胞悬液，按（１～２）×１０５个／１００μＬ的浓度加入９６孔培养板，每组至少３复孔。５．４．２　对照组应设立一组不加刺激剂的阴性对照组。５．４．３　加入刺激剂按照终浓度为５μｇ／ｍＬ加入刀豆蛋白Ａ，使每孔液体总量为２００μＬ。５．４．４　培养条件３７℃、５％ＣＯ２孵育６６ｈ。５．４．５　检测每孔加入２０μＬＭＴＴ，继续孵育４ｈ，弃去孔内液体，每孔加入１５０μＬ二甲基亚砜，用酶联免疫检测仪在４９０ｎｍ波长检测吸光度ＯＤ值，结果取每组平均值。６　试验结果用刺激指数ＳＩ表示，见式（１）：ＳＩ＝ＯＤ实验组ＯＤ阴性对照组×１００％…………………………（１）２犛犖／犜２４９７．１０—２０１０书书书０１０２—０１７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第１０部分：犜淋巴细胞增殖功能测定试验ＳＮ／Ｔ２４９７．１０—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数６千字２０１０年６月第一版　２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４３　定价１４．００元