SNT 2497.24-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第24部分细胞免疫功能体外检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２４—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２４：犞犻狋狉狅狋犲狊狋狅犳犮犲犾犾犻犿犿狌狀狅犾狅犵犻犮犳狌狀犮狋犻狅狀２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第２４部分。本部分修改采用《毒理学实验方法与技术》中的免疫毒理学研究方法，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吕刚、王利兵、冯智劼、李学洋、熊中强、赵好力宝。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２４—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中体外细胞免疫功能试验的试验原理、试验方法和试验结果。本部分适用于检测进出口危险化学品安全性的细胞免疫毒性的体外检测试验。２　试验原理人外周血Ｔ淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体（Ｅ受体），即ＣＤ２分子，而Ｂ淋巴细胞表面则没有。因而在体外，当将淋巴细胞与绵羊红细胞混合时，可形成以Ｔ淋巴细胞为中心，周围环绕绵羊红细胞的玫瑰花样的花环。该试验可用于检测外周血中Ｔ淋巴细胞的数目与比例。３　试验方法３．１　试剂３．１．１　淋巴细胞分离液、肝素、无钙、镁的Ｈａｎｋ′ｓ液，ｐＨ值７．２～７．６、Ａｌｓｅｖｅｒ溶液、０．８％戊二醛、０．２％冷美兰。３．１．２　绵羊红细胞用Ａｌｓｅｖｅｒ溶液保存的新鲜绵羊血经洗涤后，配制１％绵羊红细胞悬液。３．１．３　吸收灭活胎牛血清胎牛血清经５６℃３０ｍｉｎ灭活后，按每毫升胎牛血清加入洗涤过的压积绵羊红细胞０．１ｍＬ，混匀，３７℃孵育３０ｍｉｎ，然后２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清置４℃保存。３．２　试验步骤３．２．１　取肝素防凝血３ｍＬ，加３ｍＬＨａｎｋ′ｓ液对倍稀释，并沿管壁缓缓将血加到淋巴细胞分离液之上，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ。３．２．２　小心吸取分离液界面白色的单个核细胞层（含有淋巴细胞），用Ｈａｎｋ′ｓ液洗涤２次，调整细胞浓度为２×１０６个／ｍＬ备用。３．２．３　在一支新华氏管内加入淋巴细胞悬液０．１ｍＬ、经吸收灭活的胎牛血清０．１ｍＬ、１％绵羊红细胞悬液０．１ｍＬ混匀，３７℃孵育５ｍｉｎ，然后５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将试管置于４℃冰箱，至少２ｈ。３．２．４　取出试管，弃去部分上清，轻轻旋转华氏管使细胞混匀，然后沿管壁加１滴０．８％戊二醛固定，置于４℃冰箱２０ｍｉｎ。３．２．５　轻轻吸取１滴滴片，再加１滴０．２％冷美兰，染５ｍｉｎ，盖上盖玻片，高倍镜下观察玫瑰花环形成情况。４　试验结果凡淋巴细胞周围吸附３个或３个以上绵羊红细胞者即为Ｅ花环形成阳性，计数２００个淋巴细胞，计算Ｅ花环形成的百分率，见式（１）。１犛犖／犜２４９７．２４—２０１０花环形成率＝形成花环的淋巴细胞数形成花环淋巴细胞数＋未形成花环淋巴细胞数×１００％…………（１）　　正常值人外周血Ｅ花环形成率为６０％～８０％，少于５０％为降低。２犛犖／犜２４９７．２４—２０１０书书书０１０２—４２７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法ＳＮ／Ｔ２４９７．２４—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数５千字２０１０年５月第一版　２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９３０　定价１４．００元