SNT 2497.6-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第6部分哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．６—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋６：犐狀狏犻狋狉狅狊犻狊狋犲狉犮犺狉狅犿犪狋犻犱犲狓犮犺犪狀犵犲犪狊狊犪狔犻狀犿犪犿犿犪犾犻犪狀犮犲犾犾狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７的第６部分。本部分修改采用经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试指南ＮＯ．４７９《哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换（ＳＣＥ）体外试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：李宁涛、王利兵、陈练、于艳军、于智睿、李学洋。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．６—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验１　范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换（ＳＣＥ）体外试验的试验仪器、试验原理、试验方法和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品导致的染色体同源位点上ＤＮＡ复制产物互换频率的改变，检测危险化学品对细胞在Ｓ期受损伤的程度。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＯＥＣＤ４７９　哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换（ＳＣＥ）体外试验３　术语和定义ＯＥＣＤ４７９确立的以及下列术语和定义适用于本部分。３．１姐妹染色单体互换　狊犻狊狋犲狉犮犺狉狅犿犪狋犻犱犲狓犮犺犪狀犵犲染色体同源座位上ＤＮＡ复制产物的相互交换，其频率与ＤＮＡ的断裂和修复有关。４　原理在分裂的细胞中，每条染色体由两条染色单体组成，每条染色单体由双链ＤＮＡ组成。当溴脱氧尿嘧啶核苷（ＢｒｄＵ）作为核苷酸前体取代胸腺嘧啶核苷后，可掺入到ＤＮＡ新复制的核苷酸链中去。经两次复制后，两条姐妹染色单体的ＤＮＡ双链在化学组成上就有差别。一条由单股含有ＢｒｄＵ核苷酸链的ＤＮＡ所组成，而另一条单体则由双股都含有ＢｒｄＵ核苷酸的ＤＮＡ所组成。用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色时，前者着色深，后者着色浅。当两个等位染色单体间发生交换时，可根据每条染色单体内夹着深浅不同的染色片段而被识别。５　仪器和试剂———含ＢｒｄＵ的培养基；———秋水仙素或秋水仙胺；———０．２５％胰蛋白酶溶液；———２×ＳＳＣ液（即０．３ｍｏｌ／Ｌ氯化钠和０．００３ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸三钠）；———３％吉姆萨液（ｐＨ６．８磷酸缓冲液稀释）；———培养箱。１犛犖／犜２４９７．６—２０１０６　试验方法６．１　试验细胞准备６．１．１　初级培养物（如人淋巴细胞）或已建立的细胞系（如中国仓鼠卵或肺细胞）均可用于本试验。试验前应检查所用细胞是否被支原体污染并测定其核型的稳定性。采用适合的培养基和培育条件（如温度，培养用物品，ＣＯ２浓度和湿度）。６．１．２　中国仓鼠卵细胞（ＣＨＯ）平均周期为１０ｈ～１２ｈ，应培养于含１０％胎牛血清的１６４０培养基中，每瓶接种３×１０５个细胞，在处理前２４ｈ培养于１０ｍＬ的新鲜培养液中，于３７℃培养。６．２　受试物６．２．１　检测前要测定受试物的可溶性、毒性，并确定剂量水平。６．２．２　对照可选用甲基磺酸乙酯、丝裂霉素Ｃ或环磷酰胺。６．３　剂量与分组６．３．１　试验至少设３个受试物剂量水平，另设空白、溶剂对照及阳性对照。６．３．２　每个试验点至少有双份培养样本，并包括有和无代谢活化系统两种情况。６．３．３　高剂量浓度应不损伤细胞损伤的生长能力，同时应确保细胞可以复制；对不溶于水的物质，需确定适合的赋形剂；受试物相对不溶于水时，应该用其在溶剂中的极限浓度作为最大试验浓度。６．３．４　对易溶于水而无毒性的受试物，其最大浓度应根据具体情况而定。６．４　试验步骤６．４．１　受试物应在细胞的指数生长期与细胞接触（ＣＨＯ细胞约为种植后１２ｈ～１４ｈ），作用时间一般为１ｈ～２ｈ，也可以延长到两个完整的细胞周期。６．４．２　细胞应在有和无代谢活化系统的培养液中与受试物作用。６．４．３　除去含受试物的培养基，洗涤细胞后加入含ＢｒｄＵ的培养基，加入ＢｒｄＵ后，培养瓶应避光，以减少掺入了ＢｒｄＵ的ＤＮＡ发生光解作用。６．４．４　置于３７℃、５％～１０％ＣＯ２孵箱培养，收获经过两个细胞周期后的细胞。收获前１ｈ～４ｈ加入秋水仙素（终浓度０．４μｇ／ｍＬ～０．６μｇ／ｍＬ）或秋水仙胺（终浓度０．１μｇ／ｍＬ～０．２μｇ／ｍＬ）。６．４．５　培养终止后以０．２５％胰蛋白酶溶液消化，收集细胞，用标准细胞遗传学方法制备染色体标本。６．５　染色体准备与着色６．５．１　用荧光加吉姆萨法染色（也可选用其他方法）：标本在０．５μｇ／ｍＬＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８去离子水中浸泡１２ｍｉｎ后用去离子水冲洗，在日光下老化２４ｈ后放入６０℃的２×ＳＳＣ（即０．３ｍｏｌ／Ｌ氯化钠和０．００３ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸三钠）液中孵育２ｈ。６．５．２　用蒸馏水冲洗，３％吉姆萨液（ｐＨ６．８磷酸缓冲液稀释）染色３０ｍｉｎ。６．５．３　选择细胞轮廓完整、染色体展开良好、区分染色好并含有二倍体数的细胞观察计数。６．５．４　每一试验点应记录５０个中期细胞。凡在染色单体端部出现的交换记为１个ＳＣＥ，在染色单体中间出现的交换记为２个ＳＣＥ。凡在着丝点部位发生１次交换，判明不是两条染色单体在着丝点部位发生的扭转，记为１次ＳＣＥ。７　试验结果７．１　结果处理将数据列成表格，计算所有染毒组和对照组平均每个细胞的ＳＣＥ频率及每个染色体的ＳＣＥ频率，并计算其标准差。试验组与对照组的数据用双侧狋检验进行统计学分析。７．２　结果评价如果至少在一个测试浓度得到可重复的、有统计学意义的ＳＣＥ频率的增高，或细胞的平均ＳＣＥ频率随受试物浓度的增加而增加，且具有统计学意义，则试验结果为阳性。否则可认为该受试物在本测试２犛犖／犜２４９７．６—２０１０系统的试验结果为阴性。８　试验报告试验报告应包括以下内容：———受试物、溶剂的理化特性。———采用的细胞系及其来源、生长条件及制备、培养方法。———阳性对照物的选择及制备，空白、溶剂对照的设置。———代谢活化系统的制备方法及在试验中使用情况的描述。———处理条件和情况的描述，包括接触浓度的选择、接触持续时间、终止处理的方法。———每份培养标本的平均每个细胞的ＳＣＥ频率以及每个染色体的平均ＳＣＥ频率。———显著性检验及相关计算结果。———结果的评价。犛犖／犜２４９７．６—２０１０书书书０１０２—６７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口危险化学品安全试验方法第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验ＳＮ／Ｔ２４９７．６—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数７千字２０１０年５月第一版　２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９２６　定价１４．００元