SNT 2485-2010 植物病毒脱除处理规程

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４８５—２０１０植物病毒脱除处理规程犚狌犾犲狊狅犳狆犾犪狀狋狏犻狉狌狊犲犾犻犿犻狀犪狋犻狅狀２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前　　言　　本标准附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准参与起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局，华中农业大学，天赐花卉公司。本标准主要起草人：李明福、王仁睿、黄新、王国平、丁元明、潘利军、马洁。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４８５—２０１０食品伙伴网植物病毒脱除处理规程１　范围本标准规定了植物脱毒处理程序方法。本标准适用于检验检疫行业、农林业对带有病毒的植物繁殖材料的无毒无害化处理。２　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１病毒　狏犻狉狌狊病毒是肉眼不可见，依赖于寄主细胞复制，其基因组核酸外包裹着外壳蛋白的一类专性寄生的特殊微生物。２．２病毒脱除处理　狏犻狉狌狊犲犾犻犿犻狀犪狋犻狅狀应用物理、化学、生物学等方法，祛除植物所感染的病毒，使之无毒无害化的过程。２．３组织培养　狆犾犪狀狋狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体等繁殖材料，培养在人工培养基上，并在人工控制的环境下生长、分化、增殖至再生植株的过程。２．４茎尖培养　狊犺狅狅狋犪狆犻犮犲狊犮狌犾狋狌狉犲在无菌条件下剥取植物茎尖（顶端分生组织带１个～２个幼叶原基），在人工控制的条件下分化再生的方法。２．５热处理　狋犺犲狉犿狅狋犺犲狉犪狆狔植物材料置于适当的隔离设施（如：恒温恒湿箱、日光温室）中，在不同的高温条件下，持续处理一定的时间（几周或数月），以钝化植物中的病毒或降低其浓度。２．６化学处理　犮犺犲犿狅狋犺犲狉犪狆狔在植物培养基中添加一定浓度的化学物质，抑制或干扰植物组织中的病毒复制或繁殖。３　原理３．１　处理原则针对检验检疫或生产中发现植物携带管制的病毒时，一般可进行销毁处理。如因植物珍贵或应客户需求，需针对管制的病毒实施脱除处理。３．２　病毒脱除处理针对植物病毒在植物体内分布不均匀、植物病毒复制过程需要特殊酶或物质参与，植物病毒外壳蛋白受热钝化等特点，设计茎尖组织培养、化学治疗和物理治疗，以脱去病毒。１犛犖／犜２４８５—２０１０食品伙伴网４　仪器和用具４．１　仪器４．１．１　超净工作台。４．１．２　天平（０．００１ｇ）。４．１．３　解剖镜。４．１．４　光照培养箱。４．１．５　恒温恒湿箱。４．１．６　高温灭菌锅。４．２　用具４．２．１　量筒。４．２．２　容量瓶。４．２．３　接种针或解剖刀。４．２．４　镊子。４．２．５　ｐＨ计或ｐＨ试纸。５　病毒检测方法５．１　生物学检测（指示植物法）。５．２　酶联免疫法。５．３　ＲＴＰＣＲ方法。５．４　核酸杂交方法。６　植物病毒脱除处理程序６．１　病毒脱除方法６．１．１　材料剪取与灭菌在超净工作台上剪取植株茎尖１ｃｍ～２ｃｍ，自来水冲洗３０ｍｉｎ，剥去外面的叶片，将茎尖置于超净工作台上，无菌条件下进行消毒：７５％的乙醇浸泡１０ｓ，已灭菌的蒸馏水冲洗３次～５次，０．１％的升汞浸泡，加入１滴～２滴吐温，消毒５ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，已灭菌的蒸馏水冲洗３次～５次，每次２ｍｉｎ～３ｍｉｎ。６．１．２　茎尖剥离与接种把经过上一步消毒处理后的茎尖放在解剖镜下，用已灭菌的接种针或解剖刀逐层剥去幼叶，直至出现顶端分生组织，将顶端分生组织和毗邻的１个～２个叶原基切下，直立向上接种到适宜的固体培养基上。６．１．３　热处理结合茎尖培养将供试材料放入恒温恒湿箱（温度范围：３０℃～４０℃），日夜变温处理几天至几月。热处理后的材料按照上述茎尖剥离与接种步骤进行培养，参见附录Ａ。６．１．４　化学治疗结合茎尖培养筛选对病毒有抑制作用的化学药剂，如病毒唑、硫脲嘧啶等，浓度常为１０ｍｇ／Ｌ～３０ｍｇ／Ｌ，添加到培养基中，培养一月至几月，然后再按照上述茎尖剥离与接种步骤进行培养，参见附录Ａ。６．２　试管苗的病毒检测用上述病毒的检测方法检测试管苗，如果检测结果为阴性则初步定为脱病毒试管苗，进行后期的扩繁和生根移栽，如果检测结果为阳性则不是脱病毒试管苗，需要进一步进行病毒脱除处理。２犛犖／犜２４８５—２０１０食品伙伴网６．３　试管苗的扩繁与生根培养６．３．１　试管苗的扩繁检测结果为阴性的试管苗可接种到扩繁培养基上进行增殖。６．３．２　生根培养试管苗长至３ｃｍ～５ｃｍ时转至生根培养基进行培养。６．４　试管苗的驯化将生长茁壮、有３片～５片叶的试管苗移至温室进行炼苗。６．５　移栽６．５．１　过渡培养取出试管苗，洗净根部培养基，移入适宜的栽培基质中，刚移栽的试管苗要避光，湿度：８５％，温度：白天２５℃～２８℃，夜间１５℃～１８℃。避光保湿培养２ｄ～３ｄ后在正常的光照、温湿度条件下进行培养。６．５．２　移入土壤过渡培养２周后，将生长茁壮的植株移入土壤。６．６　移栽后植株的病毒复检移栽后的脱病毒植株长到一定大小需要进行病毒复检，若复检结果与第一次结果相同，均为阴性，则可认定为脱病毒苗；若复检结果与第一次结果不同，为阳性，则再生苗不是脱毒苗，需要进一步进行病毒脱除处理。６．７　扩大繁殖经过上述过程，进行两次病毒检测的无病毒植株作为健康母株，进行扩大繁殖，完成整个病毒脱除处理过程。３犛犖／犜２４８５—２０１０食品伙伴网附　录　犃（资料性附录）常见病毒脱毒方法表犃．１　常见病毒脱毒方法病毒名寄主脱毒方法百合潜隐病毒ＬＳＶ黄瓜花叶病毒ＣＭＶ郁金香碎花病毒ＴＢＶ异名百合斑驳病毒ＬＭｏＶ百合丛簇病毒ＬＲＶ百合热处理结合茎尖培养：热处理：４０℃处理５ｄ后剥取茎尖，茎尖带１个～２个叶原基，即０．２ｍｍ～０．５ｍｍ，尽量少带邻近组织菊花Ｂ病毒ＣＶＢ番茄不孕病毒ＴＡＶ菊花花叶病毒ＣｈＭＶ马铃薯Ｙ病毒ＰＶＹ马铃薯Ｘ病毒ＰＶＸ烟草花叶病毒ＴＭＶ黄瓜花叶病毒ＣＭＶ菊花（１）热处理结合茎尖培养：盆栽苗在白天４０℃、夜间３０℃条件下处理１０ｄ～２０ｄ。再进行剥取茎尖，茎尖带１个～２个叶原基。（２）化学药剂结合茎尖培养：在培养基上添加８氮鸟嘌呤、硫脲嘧啶、病毒唑，浓度范围为１０ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌ，培养４周后剥取茎尖建兰花叶病毒ＣｙＭＶ齿兰环斑病毒ＯＲＳＶ兰花化学药剂结合茎尖培养：原球茎顶端分生组织先在病毒唑中浸泡１５ｍｉｎ，然后转接到添加病毒唑的培养基上，浓度范围为２０ｍｇ／Ｌ～３０ｍｇ／Ｌ，暗培养４周，转到不含病毒唑的培养基中进行原球茎增殖马铃薯Ｘ病毒ＰＶＸ马铃薯Ｙ病毒ＰＶＹ马铃薯Ａ病毒ＰＶＡ马铃薯Ｍ病毒ＰＶＭ马铃薯Ｓ病毒ＰＶＳ马铃薯卷叶病毒ＰＬＲＶ马铃薯帚顶病毒ＰＭＴＶ马铃薯（１）热处理结合茎尖培养：将块茎放在２５℃条件下发芽，当芽长到０．５ｃｍ～１ｃｍ后放置在光照培养箱内，进行热处理，白天３６℃、１６ｈ，晚上３０℃、８ｈ，处理时间为３周～４周，剥取茎尖。（２）化学药剂结合茎尖培养：在培养基上添加８氮鸟嘌呤、硫脲嘧啶、病毒唑，浓度范围为１０ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌ，培养４周后剥取茎尖苹果褪绿叶斑病毒ＡＣＬＳＶ苹果茎沟病毒ＡＳＧＶ苹果茎痘病毒ＡＳＰＶ苹果花叶病毒ＡｐＭＶ苹果锈果类病毒ＡＳＳＶｄ苹果（１）热处理结合茎尖培养：ａ）盆栽苗热处理：在白天温度２０℃～２３℃，夜间１３℃培养，待接穗发芽长出３片～５片叶时移入热处理箱内，首先在２５℃～３０℃下处理１４ｄ，然后将温度调至３７℃±１℃，恒温处理２８ｄ，处理后剥取茎尖；ｂ）组培苗热处理：３７℃，培养３０ｄ；置３２℃恒温培养箱培养１周，然后升温至３７℃热处理２０ｄ～５０ｄ后剥取茎尖；（２）化学药剂结合茎尖培养：培养基中分别添加板蓝根和病毒唑，浓度范围为１０ｍｇ／Ｌ～４０ｍｇ／Ｌ，培养６周后剥取茎尖４犛犖／犜２４８５—２０１０食品伙伴网表犃．１（续）病毒名寄主脱毒方法葡萄扇叶病毒ＧＦＬＶ葡萄卷叶相关病毒ＧＬＲａＶｓ葡萄病毒Ａ病毒ＧＶＡ葡萄病毒Ｂ病毒ＧＶＢ番茄环斑病毒ＴｏＲＳＶ葡萄（１）热处理结合茎尖培养：ａ）盆栽苗热处理：置于２５℃～２８℃下促其抽枝快长，待新梢长出２片～３片叶后，室温升至３７℃～４０℃，经３０ｄ～３５ｄ后，切取新梢顶端０．５ｍｍ～１．０ｍｍ；ｂ）组培苗热处理：先预热处理（３２℃）７ｄ，昼３８℃夜２２℃处理２０ｄ～３０ｄ。后剥取茎尖。（２）化学药剂结合茎尖培养：在培养基上添加８氮鸟嘌呤、硫脲嘧啶、病毒唑，浓度范围为１０ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌ，培养４周后剥取茎尖李属坏死环斑病毒ＰＮＲＳＶ李矮缩病毒ＰＤＶ苹果褪绿叶斑病毒ＡＣＬＳＶ樱桃卷叶病毒ＣＬＲＶ樱桃小果病毒ＬＣｈＶ樱桃Ａ病毒ＣＶＡ樱桃（１）热处理结合茎尖培养：通常是采用３８℃作为处理温度，在３７℃～３８℃下处理２周～４周后剥取茎尖。（２）化学药剂结合茎尖培养：在培养基上分别添加２，４二氧六氢三氮杂苯（ＤＨＴ）和病毒唑，浓度范围为１０ｍｇ／Ｌ～３０ｍｇ／Ｌ，培养四周后剥取茎尖５犛犖／犜２４８５—２０１０食品伙伴网书书书０１０２—５８４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准植物病毒脱除处理规程ＳＮ／Ｔ２４８５—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．７５　字数９千字２０１０年５月第一版　２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８１１　定价１６．００元食品伙伴网