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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖/犜2428—2010犬瘟热诊断方法犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犮犪狀犻狀犲犱犻狊狋犲犿狆犲狉20100110发布20100716实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准的附录C为规范性附录,附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张子群、谢晓峰、岳志芹、何浩、徐义刚、李维刚、由轩、金宁。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖/犜2428—2010犬瘟热诊断方法1 范围本标准规定了犬瘟热(CanineDistemper,CD)的检疫技术规范,包括犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验。本标准适用于犬瘟热的检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法3 概述犬瘟热(CD)相关资料参见附录A。CD的诊断可以通过流行病学、临床症状、病理剖检变化对犬瘟热作出初步诊断,对CD作出确诊可进行病毒分离鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验等实验室诊断。4 临床诊断根据临床症状和病理学检查,参见附录B,可做初步诊断依据。5 实验室诊断技术5.1 病毒分离与鉴定5.1.1 材料准备5.1.1.1 实验材料和试剂5.1.1.1.1 Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、MDCK细胞(犬肾传代细胞)。5.1.1.1.2 溶液配制:包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS等。配方及配置方法见附录C。实验用水应符合GB/T6682要求。5.1.1.2 设备和器材5.1.1.2.1 细胞培养瓶、细胞培养板。5.1.1.2.2 吸管。5.1.1.2.3 二氧化碳培养箱。5.1.1.2.4 37℃恒温水浴箱。5.1.1.2.5 普通冰箱和低温冰箱。5.1.1.2.6 离心机及离心管。5.1.1.2.7 研磨器械。5.1.1.2.8 普通光学显微镜和倒置显微镜。5.1.1.2.9 微量加样器,容量5μL~50μL,50μL~200μL。1犛犖/犜2428—20105.1.1.2.10 0.45μm微孔滤器。5.1.1.3 组织悬液的制备CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用加双抗(含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL)的细胞维持液,制成20%组织悬液,4℃浸泡4h,然后反复冻融3次,3000r/min离心30min,取上清液,-20℃冷冻保存,备用。试验前,10000r/min离心20min,取上清液,用于CDV分离。5.1.2 操作方法5.1.2.1 细胞分离法用常规方法培养细胞单层,待长至80%左右时,用于CDV分离。吸去培养液,用无血清培养液洗涤1次。如用细胞培养瓶,按1mL/25cm2接种处理好的组织上清液,每样接种两瓶;如用细胞培养板,则按每孔0.1mL接种处理好的组织上清液,每样接种2孔。33℃吸附1h,弃去上清液,加入细胞维持液,置37℃5%二氧化碳培养箱内培养,24h后逐日观察细胞病变,连续观察5d~7d。5.1.2.2 结果观察CDV感染Vero细胞3d~4d后、MDCK细胞2d后,出现CPE变化,细胞变圆,胞浆内颗粒变性和空泡形成,随后形成巨细胞和合胞体,并在胞浆内出现包涵体。若第一次接种后未出现细胞病变,应将细胞培养物冻融后盲传三代,进行观察。如仍无细胞病变,则判为CDV检测阴性。5.1.2.3 犆犇犞的鉴定将出现细胞病变的细胞培养物,按5.2进行鉴定;或按5.3的方法制备细胞涂片,用CDV单克隆抗体进行鉴定。5.2 间接免疫荧光技术5.2.1 材料准备5.2.1.1 试剂5.2.1.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS):配制见附录C。5.2.1.1.2 CDV单克隆抗体:使用前稀释成适当的工作浓度。5.2.1.1.3 FITC荧光素标记羊抗鼠IgG抗体:使用前用0.02%伊文斯蓝稀释至工作浓度。5.2.1.1.4 碳酸盐缓冲甘油:配制见附录C。5.2.1.2 器材5.2.1.2.1 荧光显微镜。5.2.1.2.2 可调微量加样器(5μL~50μL,50μL~200μL,100μL~1000μL)。5.2.1.2.3 37℃恒温水浴箱。5.2.1.2.4 载玻片和盖玻片。5.2.1.3 样品5.2.1.3.1 细胞培养物:按5.1用24孔细胞培养板进行病毒分离培养,出现细胞病变的培养孔,吸去细胞维持液,用PBS漂洗,自然干燥。5.2.1.3.2 血液涂片:无菌采取待检犬静脉末端血,直接涂片,室温条件下自然干燥。5.2.1.3.3 组织涂片:死亡动物脏器组织(如:肝、脾、肺、脑、淋巴结等),制成涂片。5.2.2 操作方法5.2.2.1 将细胞培养物、血液涂片、组织涂片用-20℃预冷的丙酮固定10min。5.2.2.2 将固定好的细胞培养物、载玻片用PBS浸泡5min,置于37℃40min,干燥。5.2.2.3 在细胞面上或组织面上滴加稀释成适当工作浓度的CDV单克隆抗体,置于37℃30min。5.2.2.4 PBS漂洗3次,每次5min;再用蒸馏水浸泡1min,自然干燥或风干。5.2.2.5 在细胞面上或组织面上滴加稀释成适当工作浓度的免疫荧光抗体,37℃平放湿盒中30min,取出。2犛犖/犜2428—20105.2.2.6 PBS漂洗3次,每次5min;再用蒸馏水浸泡1min,脱盐。5.2.2.7 吹干后,用盖玻片及碳酸缓冲甘油封好载玻片。5.2.2.8 立即用荧光显微镜观察。5.2.2.9 测定待检样品时,每次试验同时设病毒对照和不接毒细胞对照。5.2.3 结果判定病毒对照的单个或成团细胞的细胞浆内出现弥漫或颗粒型的特异性苹果绿色荧光信号;不接毒细胞对照无特异性苹果绿色荧光信号,则试验成立,可进行结果判定。分离病毒孔或载玻片,单个或成团细胞的细胞浆内出现弥漫或颗粒型的特异性苹果绿色荧光信号,细胞核染成暗黑色,判为阳性。分离病毒孔或载玻片,单个或成团细胞的细胞浆染成橘红色或无特异性暗黄色,无特异性苹果绿色荧光信号,细胞核呈暗黑色,判为阴性。5.3 免疫酶试验5.3.1 材料准备5.3.1.1 试剂5.3.1.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS):配制见附录C。5.3.1.1.2 抗原涂片的制备:将CDV接种长至80%左右的细胞单层,连续观察5d~7d,细胞病变达50%~75%时,用胰蛋白酶消化分散感染细胞,PBS洗涤3次后,稀释至每毫升1×106个细胞。取印有10个~40个小孔的室玻片,每孔滴加10μL。室温自然干燥后,冷丙酮(4℃)固定10min。密封包装,置-20℃备用。5.3.1.1.3 标准阳性血清和标准阴性血清:由指定单位提供。5.3.1.1.4 酶结合物:HRP标记的SPA,使用时用PBS稀释至工作浓度。5.3.1.1.5 底物溶液:配制见附录C。5.3.1.2 器材5.3.1.2.1 普通光学显微镜。5.3.1.2.2 印有10个~40个小孔的室玻片。5.3.1.2.3 可调微量加样器(5μL~50μL)。5.3.1.2.4 37℃恒温水浴箱。5.3.1.3 样品采集被检犬血液,分离血清,血清应新鲜、透明、不溶血、无污染,密封于灭菌小瓶或离心管内,4℃或-30℃保存后,立即送检。试验前将被检血清统一编号,并用PBS作10倍稀释。5.3.2 操作方法5.3.2.1 取出抗原涂片,室温干燥后,滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清,每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔,置湿盒内,37℃30min。5.3.2.2 PBS漂洗3次,每次5min,室温干燥。5.3.2.3 滴加稀释成工作浓度的酶结合物,置湿盒内,37℃30min。5.3.2.4 PBS漂洗3次,每次5min。5.3.2.5 将室玻片放入底物溶液中,室温下显色5min~10min。PBS漂洗2次,再用蒸馏水漂洗1次。5.3.2.6 吹干后,在普通光学显微镜下观察,判定结果。5.3.3 结果判定5.3.3.1 在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下,即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色;阳性血清与正常细胞反应无色,与病毒感染细胞反应成棕黄色至棕褐色,即可判定结果;否则应重试。3犛犖/犜2428—20105.3.3.2 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色,即可判为CDV抗体阴性。5.3.3.3 待检血清与正常细胞反应呈无色,而与病毒感染细胞反应成棕黄色至棕褐色,即可判为CDV抗体阳性。5.4 免疫酶组织化学试验5.4.1 材料准备5.4.1.1 试剂5.4.1.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS):配制见附录C。5.4.1.1.2 标准阳性血清和标准阴性血清:由指定单位提供。5.4.1.1.3 酶结合物:HRP标记的SPA,使用时用PBS稀释至工作浓度。5.4.1.1.4 过氧化氢甲醇溶液:配制见附录C。5.4.1.1.5 盐酸乙醇溶液:配制见附录C。5.4.1.1.6 胰蛋白酶溶液:配制见附录C。5.4.1.1.7 底物溶液:配制见附录C。5.4.1.2 器材5.4.1.2.1 普通光学显微镜。5.4.1.2.2 可调微量加样器(50μL~200μL)。5.4.1.2.3 石蜡切片机或冷冻切片机。5.4.1.2.4 载玻片和盖玻片。5.4.1.2.5 37℃恒温培养箱或水浴箱。5.4.1.3 样品对疑似CDV的病死犬或扑杀犬,立即采集肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结和脑等组织,置冰瓶内立即送检,不能立即送检的,将组织块切成1cm×1cm左右大小,浸于10%福尔马林溶液中固定,保存、送检。5.4.2 操作方法5.4.2.1 新鲜组织按常规方法制成冰冻切片或石蜡切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10min~15min;新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片,常规脱腊至PBS(切片应用白胶或铬明胶做粘合剂,以防脱片)。5.4.2.2 去内源酶:用过氧化氢甲醇溶液或盐酸乙醇溶液37℃作用20min。5.4.2.3 胰蛋白酶消化:室温下,用胰蛋白酶溶液消化处理2min,以便充分暴露抗原。5.4.2.4 漂洗:PBS漂洗3次,每次5min。5.4.2.5 封闭:滴加体积浓度为5%的新生牛血清或1∶10稀释的正常马血清,37℃湿盒中作用30min。5.4.2.6 分别加入稀释成工作浓度的标准阳性血清或标准阴性血清,37℃湿盒中作用1h;或37℃湿盒中作用30min后4℃过夜。5.4.2.7 漂洗同5.4.2.4。5.4.2.8 滴加稀释成工作浓度的酶结合物,37℃湿盒中作用1h。5.4.2.9 漂洗同5.4.2.4。5.4.2.10 底物显色:新鲜配制的底物溶液显色5min~10min后漂洗。5.4.2.11 衬染:苏木素或甲基绿衬染细胞核或细胞质。5.4.2.12 从90%乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。5.4.2.13 试验同时设阳性组织对照和阴性组织对照。5.4.3 结果判定5.4.3.1 阳性组织对照与标准阴性血清反应片、阴性组织对照和标准阳性血清与标准阴性血清反应片、被检组织与标准阴性血清反应片本底清晰,背景无非特异性着染;阳性组织对照和标准阳性血清反4犛犖/犜2428—2010应片细胞胞浆呈黄色至棕褐色着染;则试验成立。5.4.3.2 被检组织与标准阳性血清反应片细胞胞浆偶见细胞核呈黄色至棕褐色着染,即可判为CDV抗原阳性。5.4.3.3 被检组织与标准阳性血清反应片本底清晰,背景无非特异性着染,即可判为CDV抗原阴性。6 综合判定当在临床上怀疑有CDV感染时,可根据实际情况在上述方法中选一种或
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