SNT 2131.2-2010 进出口贝类腹泻性贝类毒素检测方法 第2部分 小鼠生物法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１３１．２—２０１０代替ＳＮ０２９４—１９９３进出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法第２部分：小鼠生物法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犱犻犪狉狉犺犲狋犻犮狊犺犲犾犾犳犻狊犺狆狅犻狊狅狀狊犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋２：犕狅狌狊犲犫犻狅犾狅犵狔犿犲狋犺狅犱２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　ＳＮ／Ｔ２１３１《进出口贝类食品中腹泻性贝类毒素检验方法》共分为两部分：———第１部分：荧光磷酸酶抑制法；———第２部分：小鼠生物法。本部分为ＳＮ／Ｔ２１３１的第２部分。本部分代替ＳＮ０２９４—１９９３《出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法》。本部分与ＳＮ０２９４—１９９３相比，主要变化如下：———将原标准名称修订为《贝类中腹泻性贝类毒素检验方法　第２部分：小鼠生物法》；———将范围进行了简化和修改；———增加了术语和定义；———试剂和材料中增加了１％吐温６０生理盐水的具体配制方法；———在结果计算和表述中，增加了报告表述方式；———增加了健康和安全的提示条款。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：曹际娟、王秋艳、郑秋月、徐杨、王刚、于兵、郑惠芳、赵昕、吴振兴。本部分所代替标准历次版本发布情况为：———ＳＮ０２９４—１９９３。Ⅰ犛犖／犜２１３１．２—２０１０进出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法第２部分：小鼠生物法１　范围ＳＮ／Ｔ２１３１的本部分规定了贝类及其制品中腹泻性贝类毒素的小鼠生物测定方法。本部分适用于贝类及其制品中腹泻性贝类毒素的检验。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２１３１本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１４９２５　实验动物　环境及设施３　术语和定义下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ２１３１的本部分。３．１　腹泻性贝类毒素　犱犻犪狉狉犺犲狋犻犮狊犺犲犾犾犳犻狊犺狆狅犻狊狅狀狊，犇犛犘化学结构以大田软海绵酸（ｏｋａｄａｉｃａｃｉｄ，简称ＯＡ）及其衍生物为代表的，摄食后可产生以腹泻为主要特征的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称。３．２鼠单位　犿狅狌狊犲狌狀犻狋，犕犝对体重为１６ｇ～２０ｇ的３只ＩＣＲ雄性小白鼠腹腔各注射１ｍＬ贝类提取液后，使２只或３只小鼠在２４ｈ死亡的毒力为１个鼠单位。４　试样保存和制备４．１　试样保存４．１．１　样品要有充分的代表性并尽可能没有个体差异。同时，还要有充分的个数。去壳贝肉、带壳的或罐装的等，均应采取足够的个数并使贝肉达４００ｇ以上。４．１．２　远离实验室不能及时送检的样品，除了在常温下品质不会发生变化的，应将样品置于合成树脂袋内冷冻送检。如为带壳样品，应按４．２的方法开壳，去除水分后冷冻送检。４．２　样品的制备４．２．１　生鲜带壳样品的前处理用清水彻底洗净贝类外壳，切断闭壳肌，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来物，取出贝肉。不应以加热或加药物的方法开壳。注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺（又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色）。将去壳贝肉放在孔径约２ｍｍ的金属筛网上，沥水５ｍｉｎ，按４．２．３制备检样。４．２．２　冷冻样品的前处理在室温下，使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品，按４．２．１方法清洗、开壳、淋洗取肉，此时的１犛犖／犜２１３１．２—２０１０贝肉仍呈冷冻状态，除去贝肉外部附着的冰片，轻轻抹去水分后，按４．２．３制备检样；事先已去除水分的冷冻去壳样品，室温缓化后，按４．２．３制备检样。４．２．３　制备检样对于可以切取中肠腺的贝类（如：扇贝、贻贝及牡蛎等），称量２００ｇ贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称量后作为检样备用，注意不要使中肠腺内容物污染制样工具；不便切取中肠腺的贝类样品，称量２００ｇ贝肉后，可将全部贝肉细切、混合，作为检样。５　测定方法５．１　方法提要用丙酮提取贝类中ＤＳＰ毒素，再转移至乙醚中，经减压蒸干后，再以１％吐温６０生理盐水为分散介质，制备ＤＳＰ１％吐温６０生理盐水混悬液，将该混悬液注射入小鼠腹腔，观察小鼠存活情况，计算其毒力。５．２　仪器和设备５．２．１　旋转蒸发器。５．２．２　圆底烧瓶：５００ｍＬ、２５０ｍＬ、１００ｍＬ、５０ｍＬ。５．２．３　均质器：转速１０００ｒ／ｍｉｎ以上。５．２．４　布氏漏斗。５．２．５　天平：感量０．１ｇ。５．２．６　带塞刻度试管：１５ｍＬ，具０．２ｍＬ刻度。５．２．７　分液漏斗。５．２．８　冰箱：０℃～５℃和－１５℃～－２０℃。５．２．９　一次性注射器（１ｍＬ）及注射器针头（８＃）。５．３　试剂和材料除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯或生化试剂，水为符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．３．１　丙酮，（ＣＨ３）２ＣＯ。５．３．２　无水乙醚，（ＣＨ３ＣＨ２）２Ｏ。５．３．３　１％吐温６０生理盐水：称取１．０ｇ吐温６０（Ｃ６４Ｈ１２６Ｏ２６），溶于生理盐水（０．８５％氯化钠）中，并定容至１００．０ｍＬ。５．３．４　小白鼠：体重为１６ｇ～２０ｇ的健康ＩＣＲ品系雄性小鼠。５．４　测定步骤５．４．１　试样提取５．４．１．１　将检样置于均质杯内，加３倍量丙酮均质至少２ｍｉｎ。如为小均质杯，可分两次操作。５．４．１．２　将均质好的物质倒入布氏漏斗中抽滤，收集抽提液。５．４．１．３　对残渣分别用残渣２倍量的丙酮再抽滤两次，其抽提液与５．４．１．２所得抽提液合并。５．４．１．４　将抽提液移入５００ｍＬ的圆底烧瓶中，调整旋转蒸发器水浴温度为５６℃±１℃，减压浓缩去除丙酮直至在液体表面分离出油状物。５．４．１．５　将浓缩液移入分液漏斗内，以１００ｍＬ～２００ｍＬ乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡（不能生成乳浊液），静置分层后去除水层（下层）。５．４．１．６　用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移入２５０ｍＬ或５００ｍＬ的圆底烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，３５℃±１℃）去除乙醚。５．４．１．７　用少量乙醚将浓缩物移入５０ｍＬ或１００ｍＬ圆底烧瓶中，再次减压浓缩去除乙醚。５．４．１．８　以１％吐温６０生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到１０ｍＬ，充分振摇，制成均匀ＤＳＰ１％吐温６０生理盐水混悬液。此时１ｍＬ液量相当于预先测定的２０ｇ去壳贝肉的质量，以此悬浮２犛犖／犜２１３１．２—２０１０液作为试验原液进行动物实验。５．４．１．９　以试验原液注射小鼠，２４ｈ内２只或３只小鼠死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射小鼠。稀释前，应先振荡使试液成均匀悬浮液，再取其部分以１％吐温６０生理盐水稀释。５．４．２　小白鼠试验５．４．２．１　选择体重为１６ｇ～２０ｇ的健康ＩＣＲ品系雄性小鼠６只，随机分２组：检测样品组和空白对照组（１％吐温６０生理盐水），３只／组。５．４．２．２　以振荡器使待测液（试验原液或其稀释液）成为均匀悬浮液。分别取１ｍＬ待测液或１％吐温６０生理盐水腹腔注射。注射时若有一滴以上提取液溢出，应将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。记录注射完毕时间和小鼠停止呼吸时的死亡时间，未死亡的应连续观察２４ｈ。５．４．２．３　观察时限２４ｈ内，在空白对照组小鼠正常的情况下，检测样品组若出现２只或３只小鼠死亡，则应按表１进行最小染毒量动物实验或最大稀释度实验。表１　注射量与毒力的关系试验液注射量／ｍＬ检样量ａ／ｇ毒力／（ＭＵ／ｇ）原液１．０２００．０５原液０．５１００．１４倍稀释液１．０５０．２４倍稀释液０．５２．５０．４１６倍稀释液１．０１．２５０．８１６倍稀释液０．５０．６２５１．６　　ａ以中肠腺为检样时，相当于含有中肠腺的去壳肉量。６　结果计算和表述６．１　观察时限２４ｈ内，在空白对照组小鼠正常的情况下，若检测样品组无小鼠死亡或仅有１只小鼠死亡，则报告该检测样品中ＤＳＰ毒力为：＜０．０５ＭＵ／ｇ。６．２　观察时限２４ｈ内，在空白对照组小鼠正常的情况下，若检测样品组有２只或３只小鼠死亡，则按５．４．２．３进行动物实验，并根据表１，计算检测样品中ＤＳＰ毒力并报告结果，或报告该样品的毒力为大于０．０５ＭＵ／ｇ。７　健康和安全任何ＤＳＰ含量大于０．０５ＭＵ／ｇ的样品即被认为是有害的，人类食用不安全。腹泻性贝类毒素是一种有毒的混合物，为避免腹泻性贝类毒素的危害，应戴手套进行检验操作。橡胶手套、玻璃制品等用过的器材应在５％的次氯酸钠溶液中浸泡１ｈ以上，以使毒素分解。同样，废弃的提取液等也应以上述溶液处理。所有对含有丙酮及乙醚溶液的操作应在通风橱中进行。小鼠尸体应按ＧＢ１４９２５要求焚烧处理，其排放物应达到污物焚烧排放规定要求。犛犖／犜２１３１．２—２０１０书书书０１０２—２１３１２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准进出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法第２部分：小鼠生物法ＳＮ／Ｔ２１３１．２—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数７千字２０１０年４月第一版　２０１０年４月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０６７８　定价１４．００元