SNT 1698-2010 伪狂犬病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$%&!&代替!!#$%&’())%伪狂犬病检疫规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’1%2+3456#37*3+&3+%&!&8!!8&!发布%&!!8&’8&!实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准代替了)*!#$+(,&’’+$猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程%#本标准与)*!#$+(,&’’+相比&主要技术变化如下’本标准中第-章引用了!!#$,+-$&’’&$伪狂犬病诊断技术%中第.章的内容(修改采用了!!#$,+-$&’’&$伪狂犬病诊断技术%中第&)-)/章的内容(本标准中第/章代替了$猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程%*)*!#$+(,&’’++#本标准修改采用012$陆生动物诊断试验与疫苗手册%*&’’,+中第&%$%&章制定&修改了病毒分离)345)血清中和试验的操作规程&增加了兔体接种试验)鉴别诊断261)7方法)乳胶凝集试验)免疫荧光试验的操作规程#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位’中华人民共和国深圳出入境检验检疫局)中华人民共和国广东出入境检验检疫局)中华人民共和国江苏出入境检验检疫局#本标准主要起草人’吕建强)卢体康)花群义)林志雄)张常印)姜焱)秦智锋)曹琛福)张彩虹)陶虹)阮周曦)田纯见#本标准所代替标准的历次版本发布情况为’)*!#$+(,&’’+#!!!#!#$%&!&伪狂犬病检疫规范!!范围本标准规定了伪狂犬病的病毒分离鉴定)聚合酶链式反应)兔体接种试验)血清中和试验)酶联免疫吸附试验)乳胶凝集试验及免疫荧光试验的检疫技术规范#本标准适用于进出境猪)羊)牛)犬)猫及其他易感动物伪狂犬病的检疫和诊断#%!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本*包括所有的修改单+适用于本文件#!!#$,+-$&’’&!伪狂犬病诊断技术’!病毒分离鉴定’%!!试验材料及设备8929培养液)细胞生长液)细胞维持液配方见附录7&猪肾细胞系细胞*3:;$+或仓鼠肾细胞*=:&$+)新生犊牛血清)青霉素)链霉素)’%&&微孔滤膜)细胞培养瓶)./?恒温培养箱等#’%%!操作方法’%%%!!样品采集用于病毒分离的样品可以是活猪的口咽液)鼻液*拭子+或扁桃体活组织&或来源于死亡猪或表现临床症状猪的样本&其中脑和扁桃体样本是首选#对于潜伏感染的猪&三叉神经节是分离病毒最合适的部位#牛感染该病的特征通常是搔痒&可以采集脊索的相应部位作为样本#’%%%%!样品处理在含抗生素*例如&’’1@!6青霉素和$’’A!6链霉素+的细胞培养液或常规缓冲液中对以上样品进行匀浆处理&样品与液体的比例为$B&反复冻融.次后.’’’C!DE低速离心$’DE获得上清液&经’%&&微孔滤膜过滤&然后利用其接种任何对伪狂犬病毒敏感的细胞培养系统#如果不立即接种细胞分离病毒&可以将其置于F/’?保存作为接种材料#’%%%’!接种细胞分离该病毒常使用猪肾细胞系*3:;$+&接种前采用细胞生长液培养细胞&接种后使用的细胞维持液应该含有抗生素&例如&’’1@!6青霉素和$’’A!6链霉素#将样品滤液接种到已长成单层的3:;$细胞上&接种量为最终培养维持液的$’G&./?恒温培养箱中吸附$H&然后加入8929培养维持液&置于./?恒温培养箱中培养&逐日观察#$!!#!#$%&!&’%’!观察结果通常伪狂犬病毒诱导产生的细胞病变效应*432+出现在接种后的&-H#/&H内&因此用于接种的细胞培养物应维持I#+I#当接种样品滤液后出现432时&表现为细胞变圆)聚集&成网状)细胞层脱落&有时形成合胞体#在没有明显432时&应盲传三代&如仍然无432出现&则伪狂犬病毒分离检测为阴性#’%(!病毒鉴定对于出现432的细胞培养物进行病毒鉴定&可以采用病毒中和试验)免疫荧光试验或聚合酶链式反应&出现阳性结果即可判定为伪狂犬病毒分离鉴定阳性#(!聚合酶链式反应*$%&+按照!!#$,+-$&’’&中的操作方法进行#)!兔体接种试验)%!!试验动物选择健康成年家兔&经血清中和试验)乳胶凝集试验)琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验检测&证实为伪狂犬病抗体阴性#)%%!样品处理无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织)扁桃体)淋巴结&混合后剪碎&用组织匀浆器研磨&用灭菌生理盐水配成$B乳悬液&反复冻融.次后&以.’’’C!DE离心$’DE&取上清液加入青霉素和链霉素溶液&最终浓度分别为&’’1@!6和$’’A!6&置-?冰箱中作用$&H&作为待检样品#)%’!接种试验动物将待检样品经颈部皮下注射接种&每只家兔接种$6#&6#)%(!结果观察及判定)%(%!!伪狂犬病毒感染阳性被接种动物在接种后&-H#-,H注射部位出现奇痒&家兔啃咬注射局部&导致皮肤溃烂&家兔尖叫)口吐白沫&最终死亡#)%(%%!伪狂犬病毒感染阴性观察I后&接种家兔仍健活且无奇痒症状&判为阴性#!血清中和试验%!!试验材料及设备细胞’选用对伪狂犬病毒敏感的细胞&例如3:;$细胞系或原代肾细胞#细胞培养液’根据细胞种类不同选用不同培养液&例如3:;$细胞的培养液可以是加$’G胎牛血&!!#!#$%&!&清的8929培养液#标准伪狂犬病病毒株&适宜保存于F/’?或更低的温度&或冻干保存于-?#标准阳性血清和标准阴性血清#./?二氧化碳培养箱等#%%!预备试验利用5JJIK9LJEMH法或:NCOJC法测定病毒的#418’*’GPDQQLJMLRPLCJDESJMPDTJIUQJ+&参见附录#%’!正式试验%’%!!定性试验%’%!%!!将样品血清置于+?水浴.’DE&破坏血清中的补体#%’%!%%!将未稀释的血清加入到(+孔细胞培养板中&每份.孔&每孔’6#%’%!%’!每孔加入’6含有$’’#418’!’6*或&’’’#418’!6+的伪狂犬病毒液&振荡后置于./?二氧化碳培养箱中$H#%’%!%(!每孔加入$’6细胞悬液&细胞浓度约为$%V$’细胞!6&轻微振荡使细胞均匀分布在孔的底部&然后置于./?二氧化碳培养箱中*或密封细胞板后置于./?恒温培养箱中+#%’%!%)!每次检测应设置如下对照’W+!病毒对照’将$’’#418’!’6的病毒液作$B$)$B$’)$B$’’)$B$’’’的稀释&每个稀释度的病毒液设,孔重复&每孔加’6&在加入’6培养液后置于./?二氧化碳培养箱中$H&以+%.%$%-的方式加入细胞悬液后培养(O+细胞对照’至少作&孔重复&每孔加$’’6培养液及$’6浓度约为$’’’’细胞!6的细胞悬液(M+阳性血清对照’使用已知伪狂犬病毒中和抗体滴度*#+的血清&作-#)&#)#)#!&)#!-五个稀释度&每个稀释度至少作&孔重复&每孔’6&以+%.%$%.)+%.%$%-的方式分别加入病毒悬液)细胞悬液后培养(I+阴性血清对照’以+%.%$%&)+%.%$%.)+%.%$%-的方式操作(J+被检血清对照’为了验证待检血清是否有细胞毒性作用而设立此对照&每份待检血清’6&加入’6培养液后置于./?二氧化碳培养箱中$H&然后以+%.%$%-的方式加入细胞悬液后培养#%’%!%!在试验后-,H和/&H&分别利用倒置显微镜*$’’V+观察(+孔细胞培养板&检查细胞孔中是否有毒性反应和432&只有如下对照结果成立才能判定待检样品的试验结果’W+病毒对照’病毒悬液的滴度应该在.’#418’!’6#.’’#418’!’6之间(O+细胞对照’细胞对照孔的细胞正常)无变化(M+阳性血清对照’测得的血清抗体滴度应与预期滴度相当*波动在$个滴度范围之内+(I+阴性血清对照’没有432出现(J+被检血清对照’被检血清的432检查应考虑其对细胞毒性作用的可能#%’%!%*!待检血清的检测会出现如下结果’W+在.I内&.孔均出现432的&判为阴性(O+在第.天&.孔均未出现432的&判为阳性(M+在第.天&.孔中只有$孔出现432的&判为可疑&需要重新检测(.!!#!#$%&!&I+在第.天&出现432的小斑时&判为可疑&需要重新检测(J+在待检血清对照孔及测试孔有细胞毒性效应的&判为可疑&需要重新检测#注’在试验后$+H替换新鲜培养液将降低细胞毒性效应&同时不影响特异性抗体的滴度#%’%%!定量试验%’%%%!!将样品血清置于+?水浴.’DE&破坏血清中的补体#%’%%%%!在(+孔细胞培养板上待检血清区域&每孔加入’6培养液&然后加入’6待检血清进行系列倍比稀释&每个稀释度作.孔重复&在最后一个稀释孔中混匀后弃去’6#%’%%%’!除病毒对照及每份样品的待检血清对照之外&其余孔中加入’6含有$’’#418’!’6*或&’’’#418’!6+的伪狂犬病毒液#随后的操作参照+%.%$%.)+%.%$%-#%’%%%(!检测对照设置同+%.%$%#%’%%%)!结果判读是在试验后-,H和/&H&分别利用倒置显微镜*$’’V+观察(+孔细胞培养板&检查细胞孔中是否有毒性反应和432&计算血清抗体效价#血清抗体效价$B&&判为伪狂犬病中和抗体阳性#血清抗体效价大于$B$而小于$B&&判为可疑&应采用261)7或乳胶凝集试验验证结果&或者重新采样检测&间隔期至少,I#血清抗体效价小于$B$&判为阴性#*!酶联免疫吸附试验*’()!*+*%!!检测全病毒抗体’()!**%!%!!试验材料及设备完整伪狂犬病毒抗原)酶标抗体)伪狂犬病阳性血清)阴性血清(抗原稀释液)洗涤液)样品稀释液)酶标结合物稀释液)底物液)终止液配制方法参见附录(酶标反应板)./?恒温培养箱)酶标仪#*%!%%!操作方法*%!%%%!!包被抗原以完整伪狂犬病毒抗原作为包被酶标反应板的抗原#*%!%%%%!包被酶标反应板用抗原稀释液稀释抗原&通过方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度作为工作浓度#将工作浓度的抗原加到(+孔酶标反应板上&每孔&’’6&于-?包被$,H&然后用洗涤液洗板.次&包被好的酶标反应板置于F&’?或F/’?保存备用#*%!%%%’!检测程序利用样品稀释液按$B.’稀释待检样品)阳性血清)阴性血清&加入到包被好的酶标反应板上&每孔$’’6&阳性对照和阴性对照分别作.孔重复&于./?放置.’DE#弃去板中溶液&用洗涤液洗板.次#每孔加入$’’6用酶标结合物稀释液稀释到工作浓度的酶标结合物&于./?放置.’DE#弃去板中溶液&用洗涤液洗板.次&最后一次洗完后应用吸水纸拍干#加入$’’6合适的底物溶液*如邻苯二胺;过氧化氢+&室温避光显色&DE后&每孔加入’6终止液终止显色#在酶标仪上测定-(’E波长的光吸收值*08-(’+#-!!#!#$%&!&*%!%’!结果判定可采用!!值作为临界值进行结果判定&先计算阴性对照08-(’平均值**4+和阳性对照08-(’平均值*34+&!!*样品检测08-(’值与阳性对照08-(’平均值之比+X*样品08-(’值F*4+!*34F*4+#当!!’%&判为抗体阳性(当!!#’%&判为抗体阴性#*%%!鉴别检测’()!**%%%!!试验材料及设备伪狂犬病毒A2蛋白)酶标抗体)抗伪狂犬病A2蛋白阳性血清)抗伪狂犬病A2蛋白阴性血清(抗原包被液)洗涤液)样品稀释液)酶标结合物稀释液)底物液)终止液配制方法参见附录(酶标反应板)./?恒温培养箱)酶标仪#*%%%%!简要操作流程*%%%%%!!包被抗原以伪狂犬病毒A2蛋白作为包被酶标反应板的抗原#*%%%%%%!包被酶标反应板用包被液稀释抗原&通过方阵滴定法确定最佳包被抗原浓度作为工作浓度#将工作浓度的抗原加到(+孔酶标反应板上&每孔&’’6&于-?包被$,H&然后用洗涤液洗板.次&包被好的酶标反应板置于F&’?或F/’?保存备用#*%%%%%’!检测程序检测操作见/%$%&