SNT 1182-2010 禽流感检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１８２—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３，ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４禽流感检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪狏犻犪狀犻狀犳犾狌犲狀狕犪２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）２．３．４章以及ＷＨＯ《ＷＨＯ动物流感诊断和监测手册》（ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＳＲ／ＮＣＳ／２００２．５Ｒｅｖ．１）。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３《禽流感抗体检测方法：琼脂免疫扩散试验》和ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４《禽流感微量红细胞凝集抑制试验》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３、ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４相比，主要技术变化如下：———增加了临床诊断方法；———增加了病原分离鉴定方法；———增加了禽流感病毒核酸检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高志强、乔彩霞、徐海聂、张鹤晓、薄清如、谷强、廖秀云、蒲静、罗宝正、汪琳、张伟、柏亚铎、薛景山、潘文波、周思波、王小玉。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１８２．１—２００３；———ＳＮ／Ｔ１１８２．２—２００４。Ⅰ犛犖／犜１１８２—２０１０禽流感检疫技术规范１　范围本标准规定了进出口禽类及其产品禽流感检疫的技术规范。本标准适用于禽流感的检验检疫。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１９４３８．１　禽流感病毒通用荧光ＲＴＰＣＲ检测方法ＧＢ／Ｔ１９４３８．２　Ｈ５亚型禽流感病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测方法ＧＢ／Ｔ１９４３８．３　Ｈ７亚型禽流感病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测方法ＧＢ／Ｔ１９４３８．４　Ｈ９亚型禽流感病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测方法ＧＢ１９４８９　实验室生物安全通用要求３　符号和缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＧＩＤ：　　　　　　　　琼脂凝胶免疫扩散试验ＡＩ：禽流感ＡＩＶ：禽流感病毒ｃＤＮＡ：互补ＤＮＡＤＮＡ：脱氧核糖核酸ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯ＨＰＡＩ：高致病性禽流感ＨＰＡＩＶ：高致病性禽流感病毒ＨＰＮＡＩ：需通报的高致病性禽流感ＨＡ：血凝试验ＨＩ：血凝抑制试验ＨＡＵ：血凝单位ＩＶＰＩ：静脉接种致病指数ＬＰＡＩＶ：低致病性禽流感病毒ＬＰＮＡＩ：需通报的低致病性禽流感ＭΜＬＶ反转录酶：莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶ＮＡ：神经氨酸酶试验ＮＡＩ：神经氨酸酶抑制试验ＮＡＵ：神经氨酸酶活性单位ＰＢＳ：磷酸盐缓冲盐水１犛犖／犜１１８２—２０１０ＲＴＰＣＲ：反转录—聚合酶链反应ＲＮＡ：核糖核酸ＳＰＦ：无特定病原体犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶２．５ｍｍｏｌ／ＬｅａｃｈｄＮＴＰ：４种脱氧核糖核苷酸的混合物，每种脱氧核糖核苷酸的浓度均为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ４　临床诊断４．１　流行病学ＡＩＶ的宿主广泛，各种家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。其中以鸡和火鸡感染禽流感病毒后的危害最为严重。各种日龄的禽均可感染。ＡＩＶ主要通过患禽间（包括与患禽接触的器皿）的直接接触和间接接触传染。此外，带毒的飞鸟或水禽常常成为传染源。根据ＡＩＶ的致病性不同，可分为ＨＰＡＩＶ，ＬＰＡＩＶ和无致病性ＡＩＶ。任何ＨＰＡＩＶ分离株都属于ＨＰＮＡＩ病毒。对于Ｈ５或Ｈ７亚型病毒，如果其血凝素切割位点的氨基酸序列同任何一株强毒力病毒的相应序列相似，即为ＨＰＮＡＩ病毒株；如果其血凝素切割位点的氨基酸序列同任何ＨＰＮＡＩ毒株的相应序列都不同，则为ＬＰＮＡＩ病毒。对于非Ｈ５或非Ｈ７的禽流感病毒株，如果不具有高致病性，则认为是ＬＰＡＩＶ。４．２　临床症状ＡＩ的潜伏期从几小时到３ｄ不等。ＨＰＡＩ常可引起家禽大批发病死亡，常常突然爆发，无任何临床症状而死亡。病程稍长可见精神萎顿、不食、衰弱、羽毛松乱，头翅下垂，饮欲增加。可出现水样腹泻。鸡冠和肉髯呈暗紫色，头部水肿，有时可波及到颈部，脚鳞出血等症状。结膜肿胀发炎，有时可见出血。有些病例出现神经症状，抽搐，运动失调，瘫痪和半瘫痪，失明。鼻腔内有粘性分泌物，病鸡常摇头，呼吸困难，呼吸症状的严重程度取决于气管的病变程度。对于蛋鸡，通常开始时仅有部分笼舍的鸡发病，然后逐渐传播到邻近的笼舍。出现症状后可在２４ｈ内发生死亡，死亡高峰在４８ｈ内，但有时病程可达１周，一些病重的母鸡有时可发生康复。对于肉鸡，精神沉郁，食欲不振等症状相对不明显，开始常仅表现为死亡率增加，也可出现头颈水肿和神经症状。火鸡的症状同蛋鸡相似，病程为２ｄ～３ｄ或更长，偶尔可见窦部水肿。对于家养鸭和鹅，表现为精神沉郁，厌食，腹泻等类似蛋鸡的症状，此外可见窦部水肿；幼鸭和幼鹅常表现神经症状。４．３　病理变化４．３．１　眼观病变对于最急性病例，除严重的肌肉充血和脱水外，看不到其他病变。但对于一般的急性病例，通常可看到明显的肉眼病变。头颈部皮下水肿明显。死亡鸡的眼观病变主要表现为大量充血、出血、渗出液或漏出液和坏死变化。在前驱期症状变化主要是由于眶下窦的肿胀而导致的头面部肿大，冠、肉垂出血，发绀，水肿。在腿部还可看到充血、出血等。随着病程进展，内脏变化较大，表现为各器官的出血、变性和坏死。内脏器官浆膜面和粘膜面斑块出血，特别是腺胃、肌胃连接处附近的腺胃粘膜面出血严重。气管粘膜充血，出血，积有干酪样分泌物，心外膜及冠状沟出血，血管受损，水肿，有出血点，有时可见胰腺出血或有淡黄色坏死点。４．３．２　组织学病变组织学病变主要见于心脏、脾脏、肾脏、脑、肉髯及卵巢等脏器和组织，主要特征为水肿、充血、出血和血管周围的淋巴细胞管套形成为特征。在心、脾、肾等内脏气管和组织中，可见到嗜酸性细胞和异嗜２犛犖／犜１１８２—２０１０性细胞的浸润及坏死灶的形成。脑的病变为充血，坏死，淋巴细胞管套形成，神经胶质细胞浸润和血管增生等一系列非化脓性脑炎的病理变化。５　实验室诊断５．１　病原分离鉴定５．１．１　实验室生物安全要求ＡＩＶ病原分离鉴定以及致病性测定应在具有生物安全３级条件的实验室中进行，实验室条件符合ＧＢ１９４８９要求。５．１．２　设备、材料和试剂５．１．２．１　设备———高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）；———台式离心机（离心速度３０００ｒ／ｍｉｎ）；———旋涡振荡器；———冰箱（２℃～８℃和－２０℃两种）；———微量可调移液器（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）。５．１．２．２　材料和试剂采样用：———棉拭子、剪刀、镊子、注射器、１．５ｍＬ离心管、研钵。采样工具应经１２１℃±２℃，１５ｍｉｎ高压灭菌并烘干；———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ；———抗生素：青霉素、链霉素。鸡胚接种用：———照蛋器、打孔器、酒精灯；———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ；———５％碘酊；———７０％酒精；———１．０ｍＬ一次性灭菌注射器；———石蜡；———９日龄～１１日龄ＳＰＦ鸡胚。ＡＧＩＤ鉴定用：———酒精灯；———琼脂板，制备方法见附录Ｂ；———标准抗原，标准阴性和阳性血清。ＨＡ以及ＨＩ鉴定用：———９６孔Ｖ型微量反应板，振荡器，２５μＬ微量加样器；———阿氏（Ａｌｓｅｖｅｒｓ）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录Ｃ；———ｐＨ７．２，０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，配制方法见附录Ａ；———标准离流感病毒血凝素分型抗原，分型阳性血清和阴性血清。ＮＡ及ＮＡＩ鉴定用：３犛犖／犜１１８２—２０１０———０．４ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．９的磷酸缓冲液，配制方法见Ｄ．１；———胎球蛋白溶液，配制方法见Ｄ．２；———过碘酸盐试剂，配制方法见Ｄ．３；———亚砷酸盐试剂，配制方法见Ｄ．４；———硫代巴比妥酸试剂，配制方法见Ｄ．５；———酸化正丁醇试剂，配制方法见Ｄ．６；———０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．３ＰＢＳ，配制方法见Ｄ．７。病毒株致病性测定用：———６周龄ＳＰＦ鸡，１０只；———新鲜无菌的鸡胚感染尿囊液，且血凝价大于１／１６；———无ＲＮＡ酶的带滤芯吸头；———无ＲＮＡ酶的离心管（１．５ｍＬ）；———病毒ＲＮＡ提取试剂ＴＲＩＺＯＬ；———ＲＴＰＣＲ酶颗粒（如ＡｍｅｒｓｈａｍＲｅａｄｙｔｏＧｏＲＴＰＣＲＢｅａｄｓ或其他等效试剂）；———ＤＥＰＣ处理的灭菌双蒸水，配制方法见Ｅ．１；———５０×ＴＡＥ缓冲液，配制方法见Ｅ．２；———０．８％琼脂糖凝胶，配制方法见Ｅ．３；———１０×电泳上样缓冲液，配制方法见Ｅ．４；———ＤＮＡ分子量标准。５．１．３　采样、送检和处理５．１．３．１　活禽样品咽喉拭子采样：采样时要将拭子深入喉头及上腭裂来回刮３次～５次，取咽喉分泌液。泄殖腔拭子采样：将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便。将采样后的咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有１．０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００００ＩＵ／ｍＬ）的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。对于小珍禽，直接采集新鲜粪便１．０ｇ以上，放入盛有１．０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００００ＩＵ／ｍＬ）的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。５．１．３．２　死禽及禽肉产品对于死禽，应采集肠内容物以及包括气管、肺、气囊、小肠、脾、肾、脑、肝、心等组织脏器；对于禽类产品，可直接采集相应样品２．０ｇ以上。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品２．０ｇ于研钵中充分研磨，再加１０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００００ＩＵ／ｍＬ）混匀，或置于组织匀浆器中，加入１０ｍＬＰＢＳ（含青霉素１００００ＩＵ／ｍＬ，链霉素１００００ＩＵ／ｍＬ）匀浆，然后将组织悬液转入无菌１．５ｍＬ离心管中３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液转入另一无菌１．５ｍＬ离心管中，编号备用。５．１．３．３　血清或血浆用无菌注射器直接吸收至无菌１．５ｍＬ离心管中，编号备用。５．１．３．４　样品保存上述样品应尽快处理，可在４℃保存４ｄ，如要保存更长时间，需保存于－８０℃条件下。４犛犖／犜１１８２—２０１０５．１．４　操作步骤５．１．４．１　鸡胚病毒分离５．１．４．１．１　将９日龄～１１日龄ＳＰＦ鸡胚用照蛋器照视检查，并用铅笔画出气室与胚胎位置，在气室边缘上２ｍｍ～８ｍｍ处避开血管作一标记，并在鸡胚绒毛尿囊膜血管相对较少一侧气室作标记。５．１．４．１．２　将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用５％碘酊消毒蛋壳气室后，用７０％的酒精脱碘消毒，用无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔（勿损伤壳膜）。５．１．４．１．３　用１．０ｍＬ注射器吸取０．２ｍＬ处理好的样品，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜注入尿囊腔，如图１所示。每个样品接种５个鸡胚。图１５．１．４．１．４　接种后，加热熔化石蜡封孔，于３５℃～３７℃孵化箱内孵育９６ｈ，１８ｈ后开始观察鸡胚死亡情况，以后每间隔８ｈ观察一次，记录鸡胚死亡情况。５．１．４．１．５　收集尿囊液：对于１８ｈ以后的死胚以及９６ｈ仍存活的鸡胚，于４℃冷却４ｈ～１２ｈ后，无菌收取尿囊液。５．１．４．２　尿囊液血凝性测定对于５．１．４．１．５收集的尿囊液，应用血凝试验测定其血凝性：———在微量反应板的１孔～１２孔每孔均加入０．０２５ｍＬＰＢＳ；———吸取０．０２５ｍＬ鸡胚尿囊液加入第１孔，混匀；———从第１孔吸取０．０２５ｍＬ液体加入第２孔，混匀后吸取０．０２５ｍＬ液体加入第３孔，如此对倍稀释至第１１孔，吸弃０．０２５ｍＬ；———每孔再加入０．０２５ｍＬＰＢＳ；———每孔加入０．０２５ｍＬ１％的鸡红细胞悬液（加之前，红细胞悬液要充分摇匀）；———轻轻振荡混匀，在２０℃～２５℃下静置４０ｍｉｎ后观察结果（也可于４℃下静置６０ｍｉｎ后观察结果）。５．１．４．３　结果判定　　对照孔（第１２孔）红细胞应呈现明显的纽扣状沉淀于孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪