肠道菌群全面研究方案

肠道菌群是寄居在人体肠道内的微生物群，人体肠道内寄生的细菌数目40万亿个，基因总数约为人自身基因数目的150倍。从数据可以看出肠道菌群是一个非常庞大的群体，因此肠道菌群也被称作人体的“第二基因组”，“第二大脑”，“肠脑”。肠道菌群可以消化食物成分、合成必需维生素、刺激和调节免疫系统、排除病原体、清除毒素和致癌物、支持肠道功能等。肠道菌群在正常情况下可以和宿主及外部环境建立起动态的生态平衡，一旦肠道菌群紊乱平衡失衡，会引发宿主多种功能丧失，如屏障功能丧失，炎症和免疫功能丧失等，从而诱发疾病。据报道95%的疾病都和肠道菌群有关系，除了胃肠道疾病，代谢性疾病，肠道菌群还和多种系统疾病相关，如神经系统，呼吸系统，心血管系统，肿瘤等疾病相关。肠道菌群主要通过小分子的代谢物（如短链脂肪酸、胆汁酸、色氨酸、氨基酸等）与宿主进行密切的相互作用，影响疾病的发生发展。肠道菌群已成为近几年研究热点，但随着研究的深入，对肠道菌群的研究也要求越来越高，单一组学很难对复杂的生物学过程和生物网络调控机制进行完整的阐释，也很难满足高分文章的需求，多组学数据可以相互验证，减少单一组学分析带来的假阳性，实现从原因和结果多个层面探究生物学问题，使我们的研究更全面、更可靠。目前针对肠道菌群的研究可以分成两部分，一部分是对肠道菌群的组成及功能进行研究，即微生物组测序，一部分是对肠道菌群的代谢产物进行研究，即代谢组检测，而肠道菌群全面的研究策略是结合微生物组和代谢组的研究结果，通过物种与代谢产物的关联分析及代谢通路或基因功能与代谢产物的关联分析，综合研究肠道菌群结构和功能的改变对代谢表型以及功能性代谢小分子的影响，从物种、基因、代谢通路以及代谢物等层面综合阐述疾病发生发展机制以及药物靶点等。1.肠道菌群结构和功能由于99%微生物无法分离培养，大大限制了对微生物组成和功能的研究。微生物组高通量测序技术的出现，使得无需分离培养单个微生物，即可对样本中的微生物展开全面研究，代表性技术为16S/ITS扩增子测序及宏基因组测序技术。（1）16S/ITS扩增子测序16S/ITS扩增子测序是对样本中细菌的16SrRNA和真菌的ITS基因序列进行高通量测序。细菌的16SrRNA基因和真菌的ITS基因结构既具有保守性，又具有高变性。通过对某一段高变区序列（如V3-V4区域或ITS1区域）或全长进行PCR扩增后进行高通量测序，与数据库比对得到物种注释信息，可以了解样本中的菌群组成及丰度，以及组间差异菌群。（2）宏基因组测序宏基因组测序以样本中所有微生物基因组为研究对象，将样品中的所有基因组DNA随机打断成300bp左右的小片段，在片段两端加入通用引物进行高通量测序，再通过组装的方式将小片段拼接成较长的序列，分别和物种数据库和功能数据库比对，进行微生物群落结构多样性，基因功能，代谢通路等分析，从而进一步发掘和研究具有应用价值的功能基因及通路。（3）如何选择16S/ITS扩增子能做的宏基因组都能做，但由于16S/ITS扩增子测序本身的限制，注释到种水平的比例较低，准确性也有待商榷，因此16S/ITS扩增子测序主要适用于属水平以上的菌群结构分析，物种的组成，多样性分析等。如果想要进行种水平甚至菌株水平的研究，以及菌群关键基因及功能等，需要进行宏基因组测序。16S/ITS扩增子测序成本较低，可以前期进行大样本量的16S/ITS扩增子测序，筛选样本进行宏基因组测序，两者的结果也可以相互验证相互补充。2.肠道菌群代谢产物代谢组学可以对生物体内所有小分子代谢物进行定性定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系。肠道菌群和宿主共代谢物质包括两类物质：宿主和肠道菌群共同代谢的物质；宿主在肠道菌群作用下代谢的物质。通过代谢组学检测肠道菌群和宿主共代谢物的动态变化，清晰展示肠道菌群在宿主中的代谢状态，可为疾病生物标志物开发，疾病发病机制和药物治疗机制等研究提供线索和方向。（1）非靶向代谢组非靶向代谢组（untargetedmetabolomics）是一种常用的代谢组学研究方法，主要研究思路为检测样本中所有代谢物，并获取定量信息，找到不同组别之间的差异代谢物。非靶采用4种定性方法，本地库3000+物质（包含保留时间RT）、公共库（代谢物15万+，谱图200万张，可启用保留时间RT预测模块提升代谢物鉴定准确性）、AI预测库（预测KEGG，HMDB物质的二级谱图72万+，物质13万+）以及MetDNA（升级版，整合Pubchem反应链7万+反应对）进行鉴定，定性使用评分制（默认筛选鉴定得分Totalscore0.5分的物质），采用8大质控，保证后续数据分析的可靠性，从鉴定到的代谢物准确性和数目上都有较大提升。将鉴定到的代谢物通过公共数据库如KEGG等进行物质溯源，可以知道哪些代谢物可能是宿主产生的，哪些代谢物可能是菌群产生的，以及哪些代谢物可能是宿主和肠道菌群共代谢物质。非靶可以对4.8万个代谢物进行溯源，其中3.5万个代谢物可能是宿主产生的，4041个代谢物可能是菌群产生的，以及9287个代谢物可能是宿主和肠道菌群共代谢物质，下表为非靶数据库中共代谢物质各分类数目。（详情点击进入官网咨询）（2）广泛靶向代谢组广泛靶向代谢组，整合了非靶向代谢组“广泛性”和靶向代谢组“准确性”的优势，针对医学研究方向的自建数据库，数据库经标准品和生物样本反复验证，包括1800+代谢物，覆盖了医学样本中大部分物质类型；采用超高灵敏度ABSCIEXQTRAP6500+质谱仪，定性使用保留时间Rt及Q1/Q3多离子对，多个离子准确定性一个物质，采用MRM模式（双重过滤，定量金标准）进行相对定量。广泛靶向代谢组可以对650个代谢物通过数据库进行溯源，其中525个代谢物可能是宿主和肠道菌群共代谢物质，下表为广靶数据库中共代谢物质各分类数目。物质一级分类共代谢脂质类1957有机酸及其衍生物1696有机氧化物1244杂环化合物1101苯环化合物830核苷酸及其代谢物703苯丙烷类592有机氮化合物172生物碱及其衍生物93氨基酸69其他830总9287物质一级分类共代谢有机酸及其衍生物91氨基酸及其代谢物80核苷酸及其代谢物62苯及其衍生物56碳水化合物及其代谢物37杂环化合物35醇、胺类29辅酶和维生素26氧化脂质26脂肪酰类20醛、酮、酯类17激素及激素相关物质15色胺、胆碱、色素10胆汁酸8鞘脂类5甘油磷脂类3其他5总525（详情点击进入官网咨询）（3）TM广靶代谢组TM（TOF+MRM）广靶将非靶（高分辨、广覆盖）与广靶（高灵敏、精定量）完美结合：首先通过非靶高分辨率质谱ABTriple-TOF6600仪器采集项目混样中的代谢物二级谱图，基于本地库、公共库、AI库以及MetDNA进行鉴定，筛选鉴定得分Totalscore0.6分的物质，将高质量的代谢物与广靶数据库整合，构建该项目的专属特异性数据库（非靶Totalscore0.6+1800个自建广靶数据库），利用ABQ-TRAP6500+对库中物质开展MRM精准检测，在极大提升有效数据量的同时又保证了每个代谢物定量的精准性，弥补了数据库中可能不包含的物质，通量更大，尤其适合“多物种”复杂样本（同时包含宿主、微生物等）。通过TM广靶代谢组可以对4.8万+代谢物进行溯源，综合非靶和广靶物质溯源结果，更适合肠道菌群研究。（4）靶向代谢组除了广筛性代谢组研究，还可以针对关注的代谢物进行靶向代谢组检测，通过构建标准曲线，可以实现绝对定量，定量结果更准确，如常见的肠道菌群代谢物短链脂肪酸、胆汁酸、氧化三甲胺、色氨酸、氨基酸等。3.微生物组和代谢组联合分析通过16S扩增子与宏基因组测序得到差异菌群和差异功能，通过代谢组检测得到差异代谢物，将差异菌群和差异功能进行联合分析，挖掘关键菌群和功能以及代谢物，在宿主生理、疾病病理、药物药理等方面取得众多进展，具有良好的应用前景。（详情点击进入官网咨询）下面以一篇16S+代谢组客户文章为例，探究PM2.5暴露对小鼠肺部微生物及代谢产物的影响。（详情点击进入官网咨询）PM2.5暴露扰动小鼠肺部微生物及代谢谱●期刊：ScienceoftheTotalEnvironment●发表时间：2020●影响因子：6.551一、摘要由于细颗粒物（PM2.5）对健康的不利影响，已成为主要的公共卫生问题。肺被认为是受PM2.5影响的主要器官。为了了解PM2.5引起的肺损伤的机制，通过16SrRNA扩增子测序和液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学分析，研究PM2.5暴露对肺部微生物和代谢谱的影响。通过气管内滴注使小鼠暴露于PM2.5，构建肺损伤模型。16SrRNA扩增子测序表明，PM2.5暴露显著改变了肺微生物组的丰富度，均匀度和组成。代谢组学分析显示，暴露于PM2.5后，肺部代谢产物的水平受到干扰。改变的代谢物主要属于代谢途径，例如柠檬酸循环，二羧酸代谢，丙酮酸代谢，嘌呤和嘧啶代谢以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸代谢。改变的肺微生物群显示与肺代谢产物显著相关。反丁烯二酸的水平与瘤胃球菌科，肠杆菌科和假单胞菌科的相对丰度呈负相关。这些结果表明，PM2.5暴露不仅显著改变了肺微生物组的组成，而且还扰乱了涉及多种代谢途径的许多代谢物。这项研究加深了对PM2.5暴露后肺损伤机理的理解。二、研究思路C57BL/6N小鼠分成4组，对照组（C），低浓度PM2.5暴露组（L），中浓度PM2.5暴露组（M），高浓度PM2.5暴露组（H），肺泡灌洗液进行16SrRNA扩增子测序（n=6），肺组织样本进行非靶向代谢组检测（n=6），并进行H&E染色（n=4），血清和肺泡灌洗液样本进行细胞因子测定IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17和TNF-α。（详情点击进入官网咨询）三、研究结果1.表型分析肺H&E染色结果显示，和对照组（C）相比，低浓度PM2.5暴露组（L）炎症细胞（主要是中性粒细胞）浸润到细支气管周围区域及小血管扩张，中浓度PM2.5暴露组（M）炎症细胞浸润到支气管周围区域和气腔，高浓度PM2.5暴露组（H）肺泡间隔增厚和纤维化程度比M组更明显，且细支气管周围区域的肺泡收缩和杯状细胞数量显著高于C组，PM2.5暴露以剂量依赖的方式引起了炎症细胞的浸润。细胞因子结果显示，M组和H组的血清细胞因子水平显著高于C组，而L组则没有显著差异，肺泡灌洗液中的细胞因子水平以剂量依赖的方式显著增加。肺组织病理学和细胞因子结果2.PM2.5暴露对微生物的影响16SrRNA扩增子测序结果显示，与C组相比，M和H组肺微生物组多样性显著增加（Shannon和Simpson指数），L和C组之间没有显著差异。M和H组的丰富度估计值Chao1也高于C组，仅H组和C组之间的丰富度估计值ACE有显著差异。共鉴定到1234个OTU，注释到各分类层级界，门，纲，目，科，属和种的比例分别为98.22％，73.34％，72.12％，68.72％，61.99％，35.49％和12.40％。门水平上，变形菌门Proteobacteria是小鼠肺微生物组中的主要菌群，总丰度接近90％，其次是拟杆菌门Bacteroidetes，蓝细菌Cyanobacteria和厚壁菌门Firmicutes，这些微生物在暴露于不同浓度的PM2.5后显示出差异。其中，拟杆菌门，蓝细菌和厚壁菌门在C组中的相对丰度很低，随着PM2.5浓度的增加而显著增加，尤其是在H组中。相反，C组的变形菌门相对丰度远高于H组。PM2.5暴露诱导了肺微生物组的独特结构，在PCoA图中显著区分开。UPGMA层次聚类分析表明，大多数对照和PM2.5暴露组样本聚类在各自分组中。Alpha多样性和菌群相对丰度变化3.PM2.5暴露对代谢谱的影响LC-MS代谢谱结果显示，代谢物PCA分析C组和L，M，H组明显分离，使用OPLS-DA模型分析差异代谢物（VIP≥1.0，倍数变化≥2或≤0.5且p0.05），CVSM组中共鉴定到300种差异代谢物（128上调，172下调），CVSH组中共鉴定到611种差异代谢物（260上调，351下调）。将差异代谢物进行KEGG富集分析发现，