SNT 2970-2011 国境口岸蚊类携带西部马脑炎病毒的检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２９７０—２０１１国境口岸蚊类携带西部马脑炎病毒的检测方法　犚犜犘犆犚法犇犲狋犲犮狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狅狉狑犲狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋—犚犜犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准国境口岸蚊类携带西部马脑炎病毒的检测方法　犚犜犘犆犚法ＳＮ／Ｔ２９７０—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数９千字２０１１年１１月第一版　２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６６７　定价１４．００元书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：宋锋林、耿丽梅、孙时、张晓龙、孙明亮、吴刚、薛芳、刘洪文、高玉峰。Ⅰ犛犖／犜２９７０—２０１１国境口岸蚊类携带西部马脑炎病毒的检测方法　犚犜犘犆犚法１　范围本标准规定了国境口岸蚊类携带西部马脑炎病毒的检测对象、生物安全要求、样品的保存运输、检测方法和结果判断。本标准适用于国境口岸蚊类携带西部马脑炎病毒的检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部，２００６年）３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１西部马脑炎病毒　狑犲狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊；犠犈犈犞西部马脑炎病毒为披膜病毒科甲病毒属病毒，具有甲病毒的一般形态特征。病毒粒子呈球形对称，有囊膜，直径４０ｎｍ。环跗库蚊（犆狌犾犲狓狋犪狉狊犪犾犻狊）、背点伊蚊（犃犲犱犲狊犱狅狉狊犪犾犻狊）等蚊虫为本病毒的主要传播媒介。４　检测对象出入境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。５　生物安全要求实验室生物安全要求按照ＧＢ１９４８９及《人间传染的病原微生物名录》的规定执行。６　器材与试剂６．１　器材液氮罐、冷藏箱、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、ＰＣＲ扩增仪、烘箱、水浴锅、生物安全柜、匀浆器、移液器、ＰＣＲ反应管、冻存管、离心管、塑料平皿、镊子等。１犛犖／犜２９７０—２０１１６．２　试剂Ｔｒｉｚｏｌ、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、引物、缓冲液、ＡＭＶ逆转录酶、ＤＮＡ聚合酶、ＲＮＡ酶抑制剂等。７　样品的保存运输７．１　样品的分拣、分装将捕获的蚊虫现场用三氯甲烷熏杀后，快速分拣。若条件允许，分拣过程应在简易低温装置上进行。分拣后按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平皿等），加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。７．２　样品的保存运输（物理法）分装完毕的样品，尽快装入液氮罐、冷藏箱或其他适当的冷冻（冷藏）装置，尽早送实验室处理。若采样点与实验室相距较近，也可将活体样品连同采样工具直接送实验室处理。运送过程中防止蚊虫逃逸。７．３　样品的保存运输（化学法）在装有蚊虫的密闭容器内加入５倍体积的ＲＮＡ保护剂，常温下５ｄ内送达实验室。８　样品的检测８．１　核酸（犚犖犃）提取８．１．１　犚犖犃提取方法使用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ。可参照如下方法提取总ＲＮＡ，或使用可达到同等效果的ＲＮＡ提取试剂盒：８．１．１．１　取蚊虫个体（单只或多只）放入１．５ｍＬ离心管内，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ试剂后研磨成匀浆，室温放置５ｍｉｎ。８．１．１．２　加入２００μＬ三氯甲烷，剧烈振荡１５ｓ，室温放置３ｍｉｎ，于４℃１２０００犵离心１５ｍｉｎ。８．１．１．３　小心吸出上清液，置于另一１．５ｍＬ离心管中，加入异丙醇５００μＬ，室温放置１０ｍｉｎ，４℃１２０００犵离心１０ｍｉｎ。８．１．１．４　弃上清液，加入７５％乙醇１ｍＬ洗涤，４℃７５００犵离心５ｍｉｎ。８．１．１．５　弃上清液，将沉淀自然干燥，加入适量的ＤＥＰＣ水溶解沉淀。８．１．１．６　－７０℃冻存提取的ＲＮＡ或直接用于反转录实验。８．１．２　注意事项ＲＮＡ提取过程中注意事项如下：ａ）　ＲＮＡ的提取既可单只蚊虫进行，也可多只蚊虫混合提取。根据捕获样品数量、实验目的等具体情况确定。ｂ）　样品研磨前的分装过程，注意低温、快速。尽量在冰盘、冰壶或其他低温装置上操作。ｃ）　操作全过程采取戴口罩、戴手套等措施，防止操作者的汗液、唾液中ＲＮＡ酶对样品造成污染。ｄ）　试剂和无菌水应专用，避免交叉污染。２犛犖／犜２９７０—２０１１ｅ）　尽量使用ＲＮＡ实验专用的一次性无ＲＮＡ酶污染的塑料器皿。８．２　核酸检测（一步法犚犜犘犆犚）８．２．１　引物设计根据西部马脑炎病毒Ｅ２基因序列，设计特定的上游引物和下游引物，上下游引物扩增的核酸片段长度为３５５ｂｐ。引物序列如下：上游引物　Ｐ１：５’ＧＴＴＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧＡＣＡＣＴＣＡ３’下游引物　Ｐ２：５’ＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＧ３’上下游引物合成后用纯水溶解并分装冻存于冰箱内。引物浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ。８．２．２　两步法犚犜犘犆犚８．２．２．１　使用两步法ＲＴＰＣＲ试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司产品］１）对西部马脑炎病毒进行核酸扩增，扩增片断长度为３５５ｂｐ。８．２．２．２　逆转录（ＲＴ）反应。反应总体积为１０μＬ。反应组成：氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ、１０×ＲＴ缓冲液１μＬ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２Ｏ２．７５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ、ＲＮＡ酶抑制剂０．２５μＬ、ＡＭＶ逆转录酶０．５μＬ、引物Ｐ２０．５μＬ、样品ＲＮＡ２μＬ。反应条件：５０℃，３０ｍｉｎ；９９℃，５ｍｉｎ；５℃，５ｍｉｎ。８．２．２．３　ＰＣＲ反应。反应总体积为５０μＬ。反应组成：５×ＰＣＲ缓冲液１０μＬ、热启动ＤＮＡ聚合酶（ＥｘＴａｑＨＳ）０．２５μＬ、引物Ｐ１０．５μＬ、引物Ｐ２０．５μＬ、ＲＴ反应产物１０μＬ、ＤＥＰＣ水２８．７５μＬ。反应条件：９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，３０ｓ，５８℃，３０ｓ，７２℃，１ｍｉｎ，扩增３５个循环；最后于７２℃延伸１０ｍｉｎ。８．２．２．４　对照的设立。在核酸扩增实验中同时按下列所述设阳性对照、阴性对照和空白对照：ａ）　阳性对照：以实验室养殖的、没有感染病原微生物的正常蚊虫ＲＮＡ与西部马脑炎病毒的混合ＲＮＡ为扩增模板；ｂ）　阴性对照：以实验室养殖的、没有感染病原微生物的正常蚊虫ＲＮＡ为扩增模板；ｃ）　空白对照：以ＤＥＰＣ水为扩增模板。８．３　琼脂糖凝胶电泳检测扩增结束后，在扩增产物中加入６×ＤＮＡ上样缓冲液，用含０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭的１．５％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录结果。９　结果判断９．１　质量控制有效实验结果应同时符合以下两个条件：ａ）　阴性对照和空白对照未出现特异性扩增条带；ｂ）　阳性对照在预期位置出现特异性扩增条带。１）　两步法ＲＴＰＣＲ试剂盒是由ＴａＫａＲａ公司［宝生物工程（大连）有限公司］提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。犛犖／犜２９７０—２０１１书书书犛犖／犜２９７０—２０１１９．２　结果分析９．２．１　阳性结果在实验结果有效的情况下，如待检样品在预期位置出现特异性扩增条带，则可初步判断待检样品西部马脑炎病毒ＲＴＰＣＲ检测阳性。初步判断为阳性结果的样品可通过复检或核酸序列测定进一步确认。９．２．２　阴性结果在实验结果有效的情况下，如待检样品在预期位置未出现特异性扩增条带，则可判断待检样品西部马脑炎病毒ＲＴＰＣＲ检测阴性。１１０２—０７９２犜／犖犛书号：１５５０６６·２２２６６７定价：　　１４．００元