SNT 2770-2011 国境口岸军团菌荧光PCR检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７０—２０１１国境口岸军团菌荧光犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犔犲犵犻狅狀犲犾犾犪狑犻狋犺狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准国境口岸军团菌荧光犘犆犚检测方法ＳＮ／Ｔ２７７０—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数９千字２０１１年６月第一版　２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２０５３　定价１４．００元书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心。本标准主要起草人：章琪、田桢干、方筠、何宇平、李晓虹、陈建雄、高璟瑜、邵祝军、郑剑宁、陶国宏、宋诚本、宋锋林、熊焕昌。Ⅰ犛犖／犜２７７０—２０１１国境口岸军团菌荧光犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了国境口岸军团菌荧光ＰＣＲ检验的对象、检测方法及结果报告。本标准适用于军团菌的筛选检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ２３５１　出入境口岸军团菌检验规程ＷＳ１９５　军团菌诊断标准及处理原则ＷＳ／Ｔ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用３　术语与定义下列术语和定义适用于本文件。３．１军团菌　犔犲犵犻狅狀犲犾犾犪军团菌属革兰氏阴性杆菌，军团菌科（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ），属于军团菌属，现已发现５０余种，７０多个血清型，至少有２０种可引起人感染。兼性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌生长一般需要半胱氨酸和铁。４　检测对象４．１　待检军团菌疑似阳性菌落。４．２　疑似军团菌感染的临床标本如咽拭子、肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物等。４．３　国境口岸疑似环境污染样品，如集中空调通风系统的冷却水、冷凝水，管道饮用水及其形成的沉积物、软泥等环境样品和出入境交通工具空调通风系统冷却水、冷凝水和管道饮用水。５　检测５．１　准备实验室准备检验设备和材料，所需设备和材料参见附录Ａ。实验室生物安全应符合ＧＢ１９４８９的规定。ＰＣＲ防污染措施按ＷＳ／Ｔ２３０要求。５．２　实验室检验５．２．１　样品采集疑似军团菌感染的临床标本和环境污染标本采集按照ＳＮ／Ｔ２３５１执行。１犛犖／犜２７７０—２０１１５．２．２　样品处理５．２．２．１　培养基上疑似菌落用无菌接种环从平板上挑取军团菌疑似菌落进行转种，然后收集菌体，混悬于１００μＬ的灭菌或无菌双蒸水或纯水中，模板提取见５．２．３。５．２．２．２　临床标本直接从咽拭子和肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物等临床标本中提取模板时，可取样本物不少于２００μＬ或２００ｍｇ（痰标本和支气管洗液应进行必要的酸处理），加入１ｍＬｐＨ７．４ＰＢＳ混匀，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，收集上清液于１．５ｍＬ离心管，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，吸去上清液；沉淀物用于模板提取见５．２．３。５．２．２．３　环境水样将３００ｍＬ～１０００ｍＬ水样用０．２μｍ滤膜过滤，取滤膜悬浮于１ｍＬ～５ｍＬ蒸馏水中，剪碎滤膜并放于无菌试管中，再加入３ｍＬ灭菌水。振荡混匀。吸取浓缩好的样本以８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ集菌，弃上清液，沉淀物用于模板提取见５．２．３。５．２．３　模板犇犖犃制备５．２．３．１　加热处理法在沉淀物中加入５０μＬ～１００μＬ超纯水，振荡混匀，１００℃煮沸１０ｍｉｎ，置冰上数分钟，待冷却后，１２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，上清液即可作为扩增模板。上清液可转移并保存在－２０℃备用。５．２．３．２　酚／三氯甲烷犇犖犃提取法在沉淀物中加入７００μＬＤＮＡ提取液（配方参见附录Ａ），１００℃煮沸１０ｍｉｎ，加酚／三氯甲烷（１∶１，体积比）７００μＬ，振荡混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液至另一离心管中，加入等量无水乙醇沉淀ＤＮＡ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去上清液，再加入１ｍＬ的７０％乙醇冲洗一次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，室温晾干，加入５０μＬ～１００μＬＴＥ液（或核酸溶解液）溶解沉淀，即为扩增模板。保存在－２０℃备用。５．２．３．３　试剂盒提取纯化犇犖犃法按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。５．２．４　检测５．２．４．１　用于荧光犘犆犚检测的引物和探针序列见表１。表１　军团菌属荧光犘犆犚引物和探针序列引物／探针靶基因序列（５’３’）探针上游引物下游引物１６ｓｒＲＮＡ６ＦＡＭＡＣＴＧＧＡＣＧＴＴＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧ６ＴＡＭＲＡ　ＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＧ　ＧＧＴＣＡＡＣＴＴＡＴＣＧＣＧＴＴＴＧＣＴ２犛犖／犜２７７０—２０１１５．２．４．２　阳性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照采用含有检测序列军团全基因组ＤＮＡ（或质粒）作为荧光ＰＣＲ反应的模板。空白对照用无菌水作为荧光ＰＣＲ反应的模板。５．２．４．３　荧光犘犆犚反应体系组成军团菌荧光ＰＣＲ反应体系采用以下参数：ＰＣＲ反应混合物１０μＬ，上游引物（９μｍｏｌ／Ｌ）和下游引物（９μｍｏｌ／Ｌ）各２μＬ，参比荧光ＲＯＸ（５０×）０．４μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，探针２μＬ（探针浓度可在优化过程中进行调整），超纯水１．６μＬ，补足２０μＬ。５．２．４．４　反应条件军团菌ＰＣＲ反应条件：９５℃３０ｓ：９５℃１０ｓ，６３．５℃１ｍｉｎ；４０个循环。所有相同的样品和对照都设有两孔以进行平行检测。因不同ＰＣＲ仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整ＰＣＲ退火温度和时间。６　结果报告６．１　荧光域值的设定ＰＣＲ反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的Ｃｔ值。以ＰＣＲ反应的前３个～１５个循环的荧光信号作为基线信号（噪音），荧光阈值理论上定义为基线信号的标准偏差的１０倍。在实际应用中可以根据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现Ｃｔ值为准。６．２　质控标准本标准质控标准为：———阴性对照：无扩增曲线，Ｃｔ≥４０．０：———阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ｃｔ值应＜３０．０；———否则，实验视为无效。６．３　检验结果判断及报告本标准检验结果判断及报告如下：———检验样品Ｃｔ值小于或等于３５．０时，报告军团菌荧光ＰＣＲ检测结果阳性；———检验样本Ｃｔ值大于３５．０且小于４０．０时，重复检测一次，如果Ｃｔ值仍小于４０．０，且曲线有明显的对数增长期，可报告军团菌荧光ＰＣＲ检测结果阳性，否则报告军团菌荧光ＰＣＲ检测结果阴性；———样本检测不到Ｃｔ值时，报告军团菌荧光ＰＣＲ检测结果阴性；———筛选阳性的样本按ＷＳ１９５和ＳＮ／Ｔ２３５１方法做进一步的分离鉴定。７　废弃物的处理检验过程中的废弃物，收集后进行高压蒸汽灭菌处理或其他等效的处理方法。犛犖／犜２７７０—２０１１书书书犛犖／犜２７７０—２０１１附　录　犃（资料性附录）试剂、材料和仪器设备犃．１　试剂和材料除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。犃．１．１　水用于荧光ＰＣＲ的水要使用灭菌的超纯水。犃．１．２　犇犖犃提取液称取５ｇＳＤＳ溶于１０００ｍＬＴＥ液中，高压灭菌备用。犃．１．３　１０×犘犆犚缓冲液５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾（ＫＣｌ），１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ盐酸（ｐＨ８．３），０．１％明胶，加入犜犪狇酶１Ｕ～２．５Ｕ。注：可根据产品说明书适当调整的浓度。犃．１．４　荧光犘犆犚引物、探针应为色谱纯。犃．１．５　阳性菌株或质粒与相应ＰＣＲ引物、探针匹配。犃．２　仪器设备本方法所需仪器设备如下：———实时荧光定量ＰＣＲ仪：———生物安全柜；———消毒灭菌锅；———高速台式离心机（最高离心力１２０００犵以上）；———台式离心机（最高离心力２０００犵以上）；———旋涡振荡器；———低温冰箱、冷藏冷冻冰箱；———纯水器、双蒸水器；———光化学ＰＣＲ反应管；———微量可调移液器一套（含以下四种规格：２μＬ～１０μＬ、１０μＬ～１００μＬ、１００μＬ～２００μＬ、２００μＬ～１０００μＬ）和相应吸头。１１０２—０７７２犜／犖犛书号：１５５０６６·２２２０５３定价：　　１４．００元