SNT 2797-2011 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 MPCR-DHPLC法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７９７—２０１１食品中致泻大肠埃希氏菌检测犕犘犆犚犇犎犘犔犆法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犱犻犪狉狉犺犲犪犵犲狀犻犮犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻犻狀犳狅狅犱—犕犘犆犚犇犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、郑秋月、王顺芝、高小博、李苏龙、李建民、王秋艳、赤列加措。Ⅰ犛犖／犜２７９７—２０１１食品中致泻大肠埃希氏菌检测犕犘犆犚犇犎犘犔犆法１　范围本标准规定了食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ检测方法。本标准适用于食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ快速检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ４７８９．６　食品卫生微生物学检验　致泻大肠埃希氏菌检验ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ０９７３　进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７检验方法３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＭＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）：多重ＰＣＲＤＨＰＬＣ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）：变性高效液相色谱ＴＥＡＡ：三乙基铵乙酸盐４　生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照ＧＢ１９４８９的有关规定执行。５　废弃物处理和防止污染的措施５．１　检测过程中的废弃物需经１２１℃高压灭菌处理至少３０ｍｉｎ后再弃置。５．２　检测过程中防止交叉污染的措施参照标准ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定执行。６　原理多重ＰＣＲ，又称多重引物ＰＣＲ或复合ＰＣＲ，它是在同一ＰＣＲ反应体系里加上两对以上引物，同时１犛犖／犜２７９７—２０１１扩增出多个核酸片段的ＰＣＲ反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般ＰＣＲ相同。ＤＨＰＬＣ分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对ＤＮＡ片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（ＴＥＡＡ），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与ＴＥＡＡ分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时ＴＥＡＡ分子中的三个乙基与固定相Ｃ１８表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。７　试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯，水为灭菌超纯水。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。７．１　水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。７．２　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。７．３　ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。７．４　１０×ＰＣＲ缓冲液：见Ａ．１．１。７．５　引物：引物序列见表Ａ．１。７．６　ＴＥ溶液：见Ａ．１．２。７．７　１０％ＳＤＳ。７．８　蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）。７．９　氯化钠溶液（ＮａＣｌ）：５ｍｏｌ／Ｌ和０．７ｍｏｌ／Ｌ。７．１０　１０％ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化胺）。７．１１　三氯甲烷。７．１２　异戊醇。７．１３　酚。７．１４　异丙醇。７．１５　７０％乙醇。７．１６　ＤＨＰＬＣ缓冲液：见Ａ．１．３。７．１７　双料缓冲蛋白胨水：见Ａ．１．４。８　主要仪器和设备８．１　ＰＣＲ仪。８．２　ＤＨＰＬＣ仪。８．３　离心机（离心转速１８０００犵）。８．４　ＰＣＲ超净工作台。８．５　微量可调移液器和灭菌吸头：２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ。８．６　灭菌ＰＣＲ反应管。９　方法提要与检测程序９．１　方法提要本方法采用四重ＰＣＲ同时扩增四种致泻性大肠埃希氏菌。四重ＰＣＲ产物再利用ＤＨＰＬＣ非变性条件下的ＤＮＡ分离技术，根据ＤＮＡ扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，从２犛犖／犜２７９７—２０１１而对食品中致泻性大肠埃希氏菌进行快速检测。９．２　检测程序食品中致泻大肠埃希氏菌ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ检测的流程图见图１。图１　犕犘犆犚犇犎犘犔犆法检测食品中致泻大肠埃希氏菌流程图１０　操作步骤１０．１　样品制备、增菌培养和分离以无菌操作取样品２５ｇ，粉碎后加入装有２２５ｍＬ双料缓冲蛋白胨水的无菌三角瓶或拍击式均质袋中，摇晃３ｍｉｎ～５ｍｉｎ或拍击１ｍｉｎ，将三角瓶或均质袋封口后在３６℃培养４ｈ～６ｈ（样品在冷藏或冷冻条件下保存１０ｄ之内的需要培养４ｈ；保存时间在１０ｄ以上的需要培养６ｈ）。从增菌肉汤中取出１０ｍＬ加入到装有１０ｍＬ双料缓冲蛋白胨水的试管中，混匀后在３６℃培养１８ｈ～２４ｈ。１０．２　增菌液模板犇犖犃的制备取１０．１中培养的二次增菌液１．５ｍＬ，加到１．５ｍＬ无菌离心管中，１３０００犵离心１ｍｉｎ；吸弃上清液，取沉淀，加５６７μＬＴＥ溶液（ｐＨ８．０），悬浮，加３０μＬ１０％ＳＤＳ和３μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ），混匀，３７℃温浴１ｈ；加１００μＬ氯化钠（５ｍｏｌ／Ｌ），混匀，加８０μＬＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％ＣＴＡＢ和０．７ｍｏｌ／Ｌ氯化钠），混匀，６５℃温浴１０ｍｉｎ；加等体积三氯甲烷／异戊醇（体积比为２４∶１），混匀，１３０００犵离心１０ｍｉｎ；取上清液，加等体积酚／三氯甲烷／异戊醇（体积比为２５∶２４∶１），混匀，１３０００犵离心１０ｍｉｎ；取上清液，加０．６倍体积异丙醇，轻轻混匀，１３０００犵离心１０ｍｉｎ；取沉淀，用７０％乙醇清洗２次，干燥，加１００μＬＴＥ溶液（ｐＨ８．０）溶解，此即为ＤＮＡ溶液。若不能立即检测，可保存于－２０℃备用。也可使用商业化的ＤＮＡ提取试剂盒并按其说明制备模板ＤＮＡ。用于阳性对照的菌株应按１０．２的步骤同时进行ＤＮＡ的制备操作。１０．３　犇犖犃浓度和纯度的测定取５μＬＤＮＡ溶液加ｄｄＨ２Ｏ梯度稀释至１ｍＬ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ｎｍ３犛犖／犜２７９７—２０１１和２８０ｎｍ处的光密度值。ＤＮＡ的浓度按照式（１）计算获得：犮＝犃×犖×５０／１０００…………………………（１）式中：犮———ＤＮＡ浓度，单位为微克每微升（μｇ／μＬ）；犃———２６０ｎｍ处的吸光值；犖———核酸稀释倍数。１ＯＤ２６０ｎｍ＝５０μｇ／ｍＬ双链ＤＮＡ。当ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值在１．７～１．９之间时，适宜于ＰＣＲ扩增。１０．４　犘犆犚扩增１０．４．１　ＰＣＲ反应体系（２５μＬ）：１０×ＰＣＲ缓冲液３μＬ；ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ；犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ；模板ＤＮＡ４μＬ（５０ｎｇ／μＬ）；肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌各引物对（１０μｍｏｌ／Ｌ）浓度分别为１μＬ、０．５μＬ、１μＬ、２μＬ；水补足至２５μＬ。１０．４．２　反应条件：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性６０ｓ，５６℃退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ进行３５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存反应产物。将ＰＣＲ产物进行ＤＨＰＬＣ分析。注：ＰＣＲ反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。１０．５　犇犎犘犔犆检测１０．５．１　犇犎犘犔犆分析条件１０．５．１．１　色谱柱：ＰＳＤＶＢ＆Ｃ１８ＤＮＡＳｅｐ色谱柱（４．６ｍｍ×５０ｍｍ，粒度３μｍ）。１０．５．１．２　柱温：５０℃。１０．５．１．３　流动相：０．０ｍｉｎ，５５％缓冲溶液Ａ，４５％缓冲溶液Ｂ；０．５ｍｉｎ，５０．２％缓冲溶液Ａ，４９．８％缓冲溶液Ｂ；３．６ｍｉｎ，４１．８％缓冲溶液Ａ，５８．２％缓冲溶液Ｂ；６．８ｍｉｎ，３８．２％缓冲溶液Ａ，６１．８％缓冲溶液Ｂ；９．９ｍｉｎ，３６．３％缓冲溶液Ａ，６３．７％缓冲溶液Ｂ；１３ｍｉｎ，３５％缓冲溶液Ａ，６５％缓冲溶液Ｂ。１０．５．１．４　流速：０．９ｍＬ／ｍｉｎ。１０．５．１．５　检测器：荧光检测器（光源：１５０ＷＸｅｎｏｎ灯；激发谱带宽：１５ｎｍ；发射谱带宽：１５．３ｎｍ；检测灵敏度：在波长３５０ｎｍ积分２ｓ）。１０．５．１．６　上样量：ＰＣＲ产物５μＬ。１０．５．２　犇犎犘犔犆分析１０．５．２．１　将装有ＰＣＲ产物的反应管放置在ＤＨＰＬＣ金属板的微孔中。１０．５．２．２　登录ＤＨＰＬＣ分析系统，按照１０．５．１设置ＤＨＰＬＣ分析条件，建立检测程序并运行。１０．６　质控对照设置检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子ＤＮＡ或阳性菌株ＤＮＡ，阴性对照为非目标致病菌ＤＮＡ。１１　结果及判断１１．１　质控标准１１．１．１　阴性对照：无吸收峰出现。１１．１．２　阳性对照：出现典型的ＰＣＲ产物吸收峰，且峰吸收值大于３ｍＶ。４犛犖／犜２７９７—２０１１１１．１．３　不符合上述对照质控标准的视为无效。１１．２　结果判定和报告１１．２．１　若在与阳性对照相同的出峰时间，检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌。１１．２．２　若在与阳性对照相同的出峰时间，检测样品出现典型的ＰＣＲ产物吸收峰（参见附录Ｂ），且吸收峰值大于３ｍＶ时，可判定该样品结果为可疑阳性。１１．２．３　若在与阳性对照相同的出峰时间，检测样品出现典型的ＰＣＲ产物吸收峰，但吸收峰值小于３ｍＶ时，建议样本重做。重做结果峰吸收值仍小于３ｍＶ则为阴性，否则为可疑阳性。１１．２．４　对于可疑阳性结果，应按照相关检测方法（ＧＢ／Ｔ４７８９．６和ＳＮ／Ｔ０９７３）做进一步的生化鉴定和报告。５犛犖／犜２７９７—２０１１附　录　犃（规范性附录）试剂和引物序列犃．１　试制配制犃．１．１　１０×犘犆犚缓冲液２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．４，２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。犃．１．２　犜犈缓冲液１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、ｐＨ８．０，用ＤＥＰＣ处理过的水配制并进行高压灭菌。犃．１．３　犇犎犘犔犆缓冲液缓冲溶液Ａ为０．１ｍｏｌ／ＬＴＥＡＡ；缓冲溶液Ｂ为０．１ｍｏｌ／ＬＴＥＡＡ＋２５％乙腈，缓冲溶液Ｃ为２５％乙腈；缓冲溶液Ｄ为７５％乙腈。犃．１．４　双料缓冲蛋白胨水蛋白胨　　　　２０．０ｇ氯化钠１０．０ｇ磷酸氢二钠（含１２个结晶水）　１８．０ｇ磷酸二氢钾３．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约１０ｍｉｎ，加热煮沸至完全溶解，调至ｐＨ７．２±０．１，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．２　引物序列食品中致泻大肠埃希氏菌ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ检测所用引物序列见表Ａ．１。表犃．１　食品中致泻大肠埃希氏菌犕犘犆犚犇犎犘犔犆检测所用引物序列序号基因名称致病菌名称引物序列预期片段／ｂｐ１犾狋肠产毒性大肠杆菌２犫犳狆肠致病性大肠杆菌３犻犪犾肠侵袭性大肠杆菌４狉犳犫Ｅ肠出血性大肠杆菌５’ｇｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃｃｔｃａｇｔｃ３’５’ｔｃｃｔｔｃａｔｃｃｔｔｔｃａａｔｇｇｃｔｔｔ３’５’ｇｇａａｇｔｃａａａｔｔｃａｔｇｇｇｇｇｔａｔ３’５’ｇｇａａｔｃａｇａｃｇｃａｇａｃｔｇｇｔａｇｔ３’５’ｃｔｇｇａｔｇｇｔａｔｇｇｔｇａｇｇ３’５’ｇｇａｇｇｃｃａａｃａａｔｔａｔｔｔｃｃ３’５’ａｔｔｇｃｇｃｔｇａａｇｃｃｔｔｔｇ３’５’ｃｇａｇｔａｃａｔｔｇｇｃａｔｔｇｇｃａｔｃｇｔｇ３’２１８２９４３２０４９９６犛犖／犜２７９７—２０１１附　录　犅