SNT 2759-2011 栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５９—２０１１栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪（犘犲狋狉犻）犅狌犻狊犿犪狀２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：封立平、刘会梅、王英超、厉艳、吴兴海、纪瑛、吴品珊。Ⅰ犛犖／犜２７５９—２０１１栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法１　范围本标准规定了植物检疫中栗黑水疫霉病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于栗黑水疫霉病菌寄主苗木、插枝等植物材料及其土壤和介质中的栗黑水疫霉病菌的定（参见附录Ａ）。２　原理２．１　分类地位栗黑水疫霉病菌［犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪（Ｐｅｔｒｉ）Ｂｕｉｓｍａｎ（１９２７），异名犅犔犲狆犺犪狉狅狊狆狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪Ｐｅｔｒｉ，（１９１７）等］属卵菌门（Ｏｏｍｙｃｏｔａ），卵菌纲（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ），腐霉目（ＰｙｔｈｉａＬｅｓ），腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ），疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪）。主要危害寄主的根、茎，引发树木的多种病害，如栗树的黑水病（ｉｎｋｄｉｓｅａｓｅ），桃树的根腐病（ｒｏｏｔｒｏｔ），挪威槭的茎溃疡病（ｓｔｅｍｃａｎｋｅｒ）等。２．２　鉴定依据以栗黑水疫霉病菌的寄主范围、在寄主植物上的症状、形态学特征、生物学特征为鉴定依据。３　仪器设备及试验用具３．１　生物显微镜（具油镜镜头）。３．２　具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于５０倍）。３．３　目镜和镜台测微尺。３．４　高压灭菌锅。３．５　电子天平。３．６　超净工作台。３．７　光照恒温培养箱。３．８　酒精灯。３．９　医用手术剪、镊子。３．１０　烧杯（１０００ｍＬ）。３．１１　试管（直径：１２ｍｍ）。３．１２　培养皿（直径：９ｃｍ）。３．１３　载玻片、盖玻片。３．１４　三角瓶（２５０ｍＬ）。３．１５　量筒（５００ｍＬ）。３．１６　ＰａｒａｆｉＬｍ膜或无色透明塑料袋。１犛犖／犜２７５９—２０１１４　试剂与培养基４．１　试剂４．１．１　匹马菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ），氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉＬＬｉｎ），利福平（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ），制霉菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ），五氯硝基苯（ｐｅｎｔａｃｈＬｏｒｏｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ），制霉菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ）。４．１．２　琼脂粉，玉米粉，大米粉。４．１．３　７０％酒精。４．１．４　棉蓝试剂。４．１．５　无荧光显微镜物镜镜头油（犖ｄ＝１．５１６）。４．１．６　永久封片剂。４．２　培养基４．２．１　基础培养基用于栗黑水疫霉病菌的保存和培养性状的观察、测定。采用胡萝卜琼脂培养基（ＣＡ）、大米琼脂培养基（ＲＡ）、玉米粉琼脂培养基（ＣＭＡ）。配方参见附录Ｂ。４．２．２　半选择性培养基用于栗黑水疫霉病菌游动孢子的萌发、菌株的纯化、病原菌的分离及再分离。配方参见附录Ｂ。４．２．３　豌豆琼脂培养基用于培养栗黑水疫霉病菌菌丝丛，来刺激孢子囊的产生。配方参见附录Ｂ。５　鉴定方法５．１　症状检查仔细检查寄主植物的根颈部及茎基部，是否有根腐、颈腐、茎溃疡和坏死症状。观察围茎一周皮层是否出现变黑腐烂或有明显的棕色圆形病斑，散发酒糟味，潮湿条件下病部表面可长出白色菌丝。对可疑植物和繁殖材料的介质土送实验室用组织分离、植物材料诱集、土壤和介质诱集等方法进一步检验。５．２　组织分离将病株置于大烧杯或大型玻璃容器中，在自来水流水下冲洗１ｈ～２ｈ，选取新鲜的根或茎病组织，在病健交接处切取０．５ｃｍ左右的小块，用７０％酒精消毒１ｍｉｎ，再用灭菌水浸洗１０ｓ～２０ｓ，用灭菌滤纸吸干水分后移至半选择性培养基，于２５℃～２８℃下培养５ｄ。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝，无隔多核，挑取菌丝尖端转移到基础培养基上２５℃～２８℃培养３ｄ。５．３　植物材料诱集在诱集前把感病植株组织润湿，在１０℃～１５℃，黑暗条件下保存等待处理。选取未成熟的有机苹果或梨，在上面挖直径８ｍｍ的小洞，除去里面的果肉，每个苹果或梨以最多挖取６个小洞为宜。把感病组织切成１ｃｍ×２ｃｍ长，塞入洞中，洞的外缘应与苹果边缘平齐。如果感病组织非常细小，也可在苹果或梨上造成切口，把感病组织（如：树皮）插入切口中。把苹果或梨密封于塑料袋中，在室温下培养２犛犖／犜２７５９—２０１１４ｄ～６ｄ。观察在洞或切口附近是否出现明显的棕色病变区，而且检查腐烂病变是否质地较硬，如果相符，则取洞口或切口周围苹果或梨的发病部位，切取病健交界处在半选择性培养基上进行分离培养。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝，无隔多核，挑取菌丝尖端转移到基础培养基上２５℃～２８℃培养３ｄ。５．４　土壤和介质诱集取待检植株根部残留的土壤并收集。如果土壤是干燥的，则缓慢加入无菌水，使其均匀湿润（无流动水），保存在１０℃～１５℃，黑暗条件下等待处理。土壤诱集应在土壤湿润后７ｄ之内进行。选取未成熟的苹果或梨，在上面挖直径２ｃｍ的小洞，除去里面的果肉，每个苹果或梨以最多挖取６个小洞为宜。把湿润的土壤放入洞中并充满。然后把苹果或梨密封于塑料袋中，在室温下培养４ｄ～６ｄ。观察在洞附近是否出现明显的棕色病变区，同时检查腐烂病变是否质地较硬，如果相符，则取洞口周围苹果或梨的发病部位，切取病健交界处在半选择性培养基上进行分离培养。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，有分枝，无膨大，挑取菌丝尖端转移到基础培养基上２５℃～２８℃培养３ｄ。５．５　培养物观察得到病菌纯培养物后，挑出菌丝制片。用０．５％棉蓝乳酚液包埋，用解剖针将菌丝尽量展开，观察病菌特征，拍照。５．６　孢子囊的产生采用菌丝块土壤溶液水培法，刺激分离物形成孢子囊进行观测和测量，作进一步鉴定，方法如下：每皿（直径９ｃｍ）豌豆琼脂培养基平板上倒入土壤浸出液（配制方法参见附录Ｂ）１０ｍＬ～１５ｍＬ，使之覆盖整皿培养基。移入８块～１０块已在豌豆琼脂培养基平板上培养了６ｄ的栗黑水疫霉病菌菌丝块，２５℃、黑暗条件下培养４ｄ。待菌丝丛形成后，倾取培养液，用灭菌蒸馏水洗涤菌丝丛，并把菌丝丛转入新的培养皿，每皿加入１５ｍＬ～２０ｍＬ土壤浸出液，置于２５℃、黑暗条件下培养。３ｄ～４ｄ后，孢子囊大量产生，使用体视显微镜和生物显微镜观察并测量孢子囊。５．７　有性组织的产生栗黑水疫霉病菌为异宗配合，在２０℃、黑暗条件下，将栗黑水疫霉病菌与樟疫霉菌的Ａ１交配型进行对峙培养，１５ｄ左右卵孢子产生。从距菌落中央１ｃｍ的地方分３点取卵孢子培养物，使用生物显微镜对卵孢子进行形态观察和尺寸（长×宽）测量。６　鉴定特征６．１　培养特征栗黑水疫霉病菌在基础培养基上形成棉絮状气生菌丝。无厚垣孢子。菌丝体为球状、链状或串状，无膨大。６．２　无性生殖阶段特征孢子囊卵形或椭圆型，无乳突，（４０μｍ～８１μｍ）×（２７μｍ～４６μｍ），长宽比１．４μｍ～１．６８μｍ，不易脱落。孢囊着生方式为单生或单合轴方式。６．３　有性生殖阶段特征藏卵器大多光滑，透明或淡黄色，偶有藏卵器壁呈弯曲、轻微泡状，壁厚，直径３３μｍ～５０μｍ。雄３犛犖／犜２７５９—２０１１器围生，双室，（２０μｍ～３８μｍ）×（１２μｍ～２１μｍ）。卵孢子透明或淡黄色，壁厚３μｍ～４．５μｍ，满器，直径３１μｍ～４６μｍ。６．４　栗黑水疫霉病菌与近似种的主要区别栗黑水疫霉病菌与樟疫霉病菌总是一起协同引起栗黑水病，栗黑水疫霉病菌与樟疫霉病菌的主要区别参见附录Ｃ。７　结果评定以栗黑水疫霉病菌在病材料上的症状、分离物的培养特征、无性及有性生殖阶段特征等作为鉴定依据进行综合判定。若以上特征与第６章鉴定特征吻合，则鉴定为栗黑水疫霉病菌。８　菌株和样品的保存分离并最终鉴定为栗黑水疫霉病菌的菌株应转接到试管斜面上，培养５ｄ～７ｄ后将培养物斜面中加入液体石蜡，置于室温黑暗保存。菌种保存应经登记和经手人签字，并严格防止扩散。菌株至少需保存１２个月，保存期满后需经高压灭菌处理。如发现栗黑水疫霉病菌，应同时保存植物材料及土壤样品。植物材料样品或土壤样品应置于１０℃～１５℃左右条件下妥善保存６个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经高压灭菌处理。４犛犖／犜２７５９—２０１１附　录　犃（资料性附录）栗黑水疫霉病菌的相关资料犃．１　学名栗黑水疫霉病菌［犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪（Ｐｅｔｒｉ）Ｂｕｉｓｍａｎ］。犃．２　地理分布非洲：毛里求斯；亚洲：印度；大洋洲：新西兰；欧洲：亚速尔群岛、法国、英国、意大利、波兰、葡萄牙、西班牙、瑞士、土耳其、前南斯拉夫；北美洲：加拿大、美国。犃．３　寄主范围挪威槭（犃犮犲狉狆犔犪狋犪狀狅犻犱犲狊）、花束月季（犃狀犱狉狅犿犲犱犪犳犔狅狉犻犫狌狀犱犪）、欧洲栗（犆犪狊狋犪狀犲犪狊犪狋犻狏犪）、木麻黄（犆犪狊狌犪狉犻狀犪犲狇狌犻狊犲狋犻犳狅犔犻犪）、菊花（犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犮犻狀犲狉犪狉犻犻犳狅犔犻狌犿）、欧石楠属（犈狉犻犮犪ｓｐｐ．）、山毛榉（犉犪犵狌狊狊狔犔狏犪狋犻犮犪）、复盆子（犚狌犫狌狊犻犱犪犲狌狊）、瓜叶菊（犛犲狀犲犮犻狅犮狉狌犲狀狋狌狊）（菊科）。人工接种可为害木豆（犆犪犼犪狀狌狊犮犪犼犪狀）、胡桃（犑狌犵犔犪狀狊狉犲犵犻犪）、白羽扇豆（犔狌狆犻狀狌狊犪犔犫狌狊）、南山毛榉属（犖狅狋犺狅犳犪犵狌狊ｓｐｐ．）、豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）、栎属（犙狌犲狉犮狌狊ｓｐｐ．）和英国榆（犝犾犿狌狊犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）。犃．４　传播方式土壤传播，病菌在寄主死后仍能在土壤中存活数年以上。病菌以菌丝或以卵孢子在田间或土壤中越冬，主要从伤口侵染。较高的土壤湿度、干旱和受伤等不利生长环境容易使寄主感病。潮湿和茎基部积水是诱发该病的主要条件。５犛犖／犜２７５９—２０１１附　录　犅（资料性附录）栗黑水疫霉病菌常用的基础培养基及土壤浸出液的配制方法犅．１　基础培养基犅．１．１　胡萝卜琼脂培养基（犆犃）胡萝卜２００ｇ，组织捣碎，加２００ｍＬ蒸馏水，过滤，汁液中加１５ｇ琼脂加热融化，蒸馏水补足至１０００ｍＬ。分装后１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ。犅．１．２　大米琼脂培养基（犚犃）大米粉２００ｇ，加２００ｍＬ蒸馏水，煮熟后双层纱布过滤，加２０ｇ琼脂加热融化，蒸馏水补足至１０００ｍＬ。分装后１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ。犅．１．３　玉米粉琼脂培养基（犆犕犃）玉米粉６０ｇ，加１０００ｍＬ蒸馏水，煮沸１ｈ，搅匀，双层纱布过滤，加１５ｇ琼脂后加热溶化，蒸馏水补足至１０００ｍＬ。分装，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。犅．２　半选择性培养基１０００ｍＬ蒸馏水中加入ＣＭＡ１７ｇ，加热融化并混匀，经常规灭菌并冷却到５５℃左右时加入：匹马霉素１０ｍｇ，氨苄青霉素２００ｍｇ，利福平１０ｍｇ，制霉菌素５０ｍｇ，五氯硝基苯２５ｍｇ（均为有效成分）。犅．３　豌豆琼脂培养基１５０ｇ干豌豆破成瓣，加２００ｍＬ蒸馏水，煮熟后双层纱布过滤，加２０ｇ琼脂加热融化，蒸馏水补足至１０００ｍＬ。分装后１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ。犅．４　土壤浸出液５００ｇ土加５００ｍＬ蒸馏水，充分搅拌后静置２４ｈ，上清液用双层普通滤纸过滤，有条件的可用孔径０．２２μｍ的滤膜过滤２次除菌，或直接置于４℃冰箱保存备用。６犛犖／犜２７５９—２０１１附　录　犆（资料性附录）栗黑水疫霉病菌与近似种樟疫霉菌的主要区别表犆．１　栗黑水疫霉病菌与樟疫霉菌的主要区别特征　栗黑水疫霉病菌　犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犿犫犻狏狅狉犪（Ｐｅｔｒｉ）Ｂｕｉｓｍａｎ　樟疫霉菌　犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犻狀狀犪犿狅犿犻Ｒａｎｄｓ厚垣孢子　不产生厚垣孢子　在菌丝体末端大量产生厚垣孢子，常呈现为３个～１０个葡萄状的厚垣孢子簇生在菌丝体末端，厚垣孢子薄壁，球状，直径３１μｍ～５０μｍ菌丝体　菌丝体为球状、链状或串状，无膨大　菌丝体膨大呈珊瑚状有性组织　藏卵器壁表面呈弯曲、轻微泡状　藏卵器表面光滑犪）　栗黑水疫霉病菌菌