SNT 2545-2010 动物源性食品中热变性蛋白检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５４５—２０１０动物源性食品中热变性蛋白检测方法犜犲狊狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱狅犳狋犺犲狉犿犪犾犱犲狀犪狋狌狉犪狋犻狅狀狆狉狅狋犲犻狀犻狀犪狀犻犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犳狅狅犱２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。　本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、郑文杰、孙敏、贺艳。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５４５—２０１０食品伙伴网动物源性食品中热变性蛋白检测方法１　范围本标准规定了动物源性食品中热变性蛋白检测的ＳＤＳ聚丙烯酰胺电泳法和乳酸脱氢酶活性测定法。　本标准适用于检验动物来源的食品是否达到规定的加热温度和加热时间。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳检测方法适用于各种新鲜和加入烹饪调料的猪、牛、鸡、鸭、羊来源的肉类制品加热终点温度的检测。检测的加热温度在６５℃～８０℃。乳酸脱氢酶活性测定方法适用于没有加入调味料和没有腌制过的猪、牛、鸭、羊来源的肉类制品在加热终点温度的检测。检测的加热温度在６５℃～８０℃。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然后，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法３　术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。３．１　术语３．１．１动物源性食品　犪狀犻犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犳狅狅犱猪、牛、鸡、鸭、羊来源的肉制品。３．１．２犛犇犛聚丙烯酰胺凝胶电泳　狊狅犱犻狌犿犱狅犱犲犮狔犾狊狌犾犳犪狋犲狆狅犾狔犪犮狉狔犾犪犿犻犱犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊在ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳，大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）按质量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应，使蛋白分子相对迁移率（Ｒ″＜［ｍ］＞）的大小完全取决于分子量的高低。３．１．３热变性蛋白　狋犺犲狉犿犪犾犱犲狀犪狋狌狉犪狋犻狅狀狆狉狅狋犲犻狀蛋白质中有一部分是热稳定蛋白，另外一部分是热不稳定蛋白。热不稳定蛋白在经过一定温度和时间的加热后就改变其蛋白质的结构，或者分解成分子量小的多肽，这部分蛋白质称为热变性蛋白。３．２　缩略语３．２．１　犛犇犛犘犃犌犈　犛狅犱犻狌犿犱狅犱犲犮狔犾狊狌犾犳犪狋犲狆狅犾狔犪犮狉狔犾犪犿犻犱犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。３．２．２　犛犇犛　犛狅犱犻狌犿犱狅犱犲犮狔犾狊狌犾犳犪狋犲十二烷基硫酸钠，阳离子表面活性剂。３．２．３　犜狉犻狊　狋狉犻狊（犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾）犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三（羟甲基）氨基甲烷。１犛犖／犜２５４５—２０１０食品伙伴网３．２．４　犜犈犕犈犇　犖，犖，犖，犖犜犲狋狉犪犿犲狋犺狔犾犈狋犺狔犾犲狀犲犱犻犪犿犻狀犲四甲基乙二胺。３．２．５　犔犇犎　犔犪犮狋犻犮犱犲犺狔犱狉狅犵犲狀犪狊犲乳酸脱氢酶。４　原理４．１　犛犇犛犘犃犌犈电泳检测方法当蛋白质受到热或受到其他物理及化学作用时，其特有的结构会发生变化，使其性质也随之发生改变，如溶解度降低，对酶水解的敏感度提高，失去生理活性等，这种现象称为变性作用。变性并不是蛋白质发生分解，而仅仅是蛋白质的二、三、四级结构发生变化。动物蛋白加热后热不稳定蛋百高级结构变化并且在相对分子质量上体现出来。只有部分热稳定蛋白在加热前后的相对分子质量不变。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。动物源的肉食品中经过一定温度和时间加热后，提取蛋白质并进行ＳＤＳＰＡＧＥ电泳，其条带在一定的分子量区间内与没有满足加热的样品中提取的蛋白质的图谱有明显不同，不同表现在条带的多少和浓度上。４．２　乳酸脱氢酶活性测定方法禽畜肉中的乳酸脱氢酶随着加热温度的升高而降低，在一定温度范围内两者成线形关系，从而检测乳酸脱氢酶活性可以推算出禽畜肉是否达到相应加热温度。乳酸脱氢酶活性测定的原理为乳酸和氧化型辅酶在乳酸脱氢酶的催化下生成还原型辅酶和丙酮酸，丙酮酸与２，４二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙。反应中，乳酸脱氢酶催化乳酸生成丙酮酸，然后丙酮酸与试剂中的２，４二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙。丙酮酸二硝基苯腙在碱性溶液中呈棕红色，其颜色深浅与丙酮酸浓度呈正比。由于禽畜肉中的乳酸脱氢酶在高温下被失活，因此通过检测丙酮酸二硝基苯腙即可检测乳酸脱氢酶的含量或活性，并与已被加热到规定温度的禽畜肉的标准酶活值进行比较，最终可判断样品是否达到适当的加热温度。５　试剂除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化纯试剂，水为按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．１　中等相对分子质量蛋白质标准的组成：ＲａｂｂｉｔｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅＢ９７４００Ｄａｌｔｏｎ、ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ６６２００Ｄａｌｔｏｎ、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ４２７００Ｄａｌｔｏｎ、ＣａｒｂｏｎｉｃＡｎｈｙｄｒａｓｅ３１０００Ｄａｌｔｏｎ、ＴｒｙｐｓｉｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒ２０１００Ｄａｌｔｏｎ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ１４４００Ｄａｌｔｏｎ）开封后溶于２００μＬ的双蒸水，分装于２０个小管内（每管１０μＬ），于沸水中加热５ｍｉｎ后，保存于－２０℃。使用前于室温融化，加ＤＴＴ至１００ｍｍｏｌ／Ｌ，于沸水中加热５ｍｉｎ后上样。如果用银染检测蛋白，应用１×的上样缓冲液（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ６．８，１０％甘油，２％ＳＤＳ，０．０５％溴酚蓝，１００ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ）稀释５０倍后再上样。５．２　Ａ液１００ｍＬ：２９．２ｇ丙烯酰胺，０．８ｇ犖，犖甲叉双丙烯酰胺，加去离子水定容至１００ｍＬ。５．３　Ｂ液１００ｍＬ：７５ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８），４ｍＬ１０％ＳＤＳ，２１ｍＬ加去离子水。５．４　Ｃ液１００ｍＬ：５０ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ６．８），４ｍＬ１０％ＳＤＳ，４６ｍＬ加去离子水。５．５　５倍样品缓冲液：０．６ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ＝６．８），５ｍＬ５０％甘油。２ｍＬ１０％ＳＤＳ．０．５ｍＬ２巯基乙醇，１ｍＬ１％溴酚蓝，０．９ｍＬ去离子水。５．６　１０％ＳＤＳ（十二烷基磺酸钠）。５．７　１０％过硫酸铵（ＡＰ）。５．８　ＴＥＭＥＤ（四甲基乙二胺）。５．９　染色固定液：取５０％甲醇４５４ｍＬ，冰乙酸４６ｍＬ混匀。５．１０　染色液：称取考马斯亮蓝Ｒ２５００．１２５ｇ，加上述固定液２５０ｍＬ，过滤后备用。５．１１　脱色液：冰乙酸７５ｍＬ，甲醇５０ｍＬ，加蒸馏水定容至１０００ｍＬ。２犛犖／犜２５４５—２０１０食品伙伴网５．１２　电泳缓冲液（内含０．１％ＳＤＳ，０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ０．３８４ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸缓冲液ｐＨ８．３）：称Ｔｒｉｓ６．０ｇ，甘氨酸２８．８ｇ，加入ＳＤＳ１ｇ，加蒸馏水使其溶解后定容至１０００ｍＬ，ｐＨ８．３。５．１３　１０ｍＬ离心管和１．５ｍＬ。５．１４　０．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液：称取６０．６ｇＴｒｉｓＢａｓｅ，加蒸馏水定容至１０００ｍＬ，用ＨＣｌ调节至ｐＨ６．８。５．１５　底物缓冲液：０．３ｍｏｌ／Ｌ乳酸锂。二乙醇胺２．１ｇ，乳酸锂２．９ｇ，调ｐＨ值至８．８，用水定容至１００ｍＬ。　５．１６　１１．３ｍｏｌ／ＬＮＡＤ溶液：ＮＡＤ１５ｍｇ，用水定容至２ｍＬ，４℃保存至少可用２周。５．１７　１ｍｍｏｌ／Ｌ２，４二硝基苯肼溶液：２，４二硝基苯肼１９８ｍｇ，加１０ｍｏｌ／ＬＨＣｌ１００ｍＬ，待溶解后加蒸馏水定容至１０００ｍＬ，置棕色玻璃瓶中保存。５．１８　０．４ｍｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：氢氧化钠１．６ｇ定容至１００ｍＬ。５．１９　０．５ｍｍｏｌ／Ｌ丙酮酸标准液：丙酮酸钠１１ｍｇ，以底物缓冲液溶解后定容至２００ｍＬ容量瓶，临用前配制。５．２０　ＬＤＨ标准品。６　仪器设备６．１　垂直电泳系统。６．２　水浴锅。６．３　离心机。６．４　笔式温度传感器。６．５　高速匀浆机。６．６　水浴锅。６．７　脱色摇床。６．８　组织粉碎机。６．９　天平（精确到０．００１ｇ）。６．１０　均质器。６．１１　离心机。６．１２　水浴锅。６．１３　探针式温度计。６．１４　酶标仪。６．１５　温育培养箱（５℃～６０℃）。６．１６　单道微量加样器：５０μＬ，１００μＬ，２０μＬ～２００μＬ可调，２００μＬ～１０００μＬ可调。６．１７　多通道微量加样器：５０μＬ～２５０μＬ可调。７　检测方法７．１　犛犇犛犘犃犌犈电泳检测方法７．１．１　制样称取样品的肌肉或内脏的内部组织１０ｇ，分两份。每份５ｇ，其中一份室温放置，命名样品Ｃ（ｃｏｎｔｒｏｌ）；一份在恒温水浴加热，如果报检样品有加热温度和加热时间的检测要求则按照样品报检要求检测，如果报检样品只要求检测样品是否热变性，则按照热加工温度７５℃１ｍｉｎ的要求来检测。样品中心放置温度计，待样品中心温度达到报检温度时开始计时，再加热报检规定的加热时间，命名为Ｈ（ｈｅａｔ）。样品Ｃ、样品Ｈ各加入４℃预冷的０．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液２０ｍＬ。匀浆１０ｓ，８０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ。各取１００μＬ上清液放入４℃等待上样。３犛犖／犜２５４５—２０１０食品伙伴网７．１．２　犛犇犛犘犃犌犈电泳７．１．２．１　配制聚丙烯酰胺凝胶配制分离胶浓度为１０％，厚度为１．５ｍｍ，配制１０ｍＬ，需Ａ液３．３ｍＬ，Ｂ液２．５ｍＬ，去离子水４．８ｍＬ，１０％过硫酸铵１００μＬ，ＴＥＭＥＤ１０μＬ。按照电泳槽说明书组装凝胶模具，用吸管吸取分离胶溶液，沿隔板缓慢加入模具内，小心避免产生气泡，当加入的溶液至前玻璃板１．５ｍＬ时即可，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层１ｍｍ～５ｍｍ的水层，这使凝胶表面变得平整。等待３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ，使凝胶聚合。　配制浓缩胶浓度为５％，配制４ｍＬ，需Ａ液０．６７ｍＬ，Ｃ液１．０ｍＬ，去离子水２．３ｍＬ，１０％过硫酸铵３０μＬ，ＴＥＭＥＤ５μＬ。轻轻吸去水层，用吸管吸取堆积胶溶液缓慢加入，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端，插入梳子，约３０ｍｉｎ凝胶聚合，小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，预先接好电极，将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。注：也可以使用相同浓度的聚丙烯酰胺预制胶产品。７．１．２．２　制备样品和上样取２０μＬ样品与５μＬ５×样品缓冲液在一个Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中混合，离心１０ｓ，用微量注射器吸取样品２０μＬ加入样品孔底部。７．１．２．３　电泳打开电泳仪，将电压调至２００Ｖ，恒压大约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝达到凝胶底部，关闭电源。７．１．２．４　染色戴手套将凝胶放入盛有１００ｍＬ染色固定液的容器中，在摇床上振荡３０ｍｉｎ，加入考马斯亮蓝染液２００ｍＬ染色１ｈ。弃去染液，将凝胶在水中漂洗３次，加入脱色液１００ｍＬ，振荡１ｈ后观察结果，并照相。也可以使用购买商品化的具有相同效果的染色剂和脱色剂，并按照其说明书操作。７．２　乳酸脱氢酶活性测定方法７．２．１　制样７．２．１．１　样品制备切取对照样品的肌肉几何中心组织１０ｇ，分两份。每份５ｇ，其中一份室温放置，命名该样品为Ｃ（ｃｏｎｔｒｏｌ）；一份在恒温水浴加热，如果待验样品有加热温度和加热时间的检测要求则按具体要求检测，如果待验样品只要求检测样品是否热变性，则按照热加工温度７５℃１ｍｉｎ的要求来检测，对照样品中心放置探针式温度计，待样品中心温度达到要求温度时开始计时，再加热到所要求的加热时间，命名该样品为Ｈ（ｈｅａｔ）。