SNT 2271-2009 青椒中转基因成分定性PCR检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２７１—２００９青椒中转基因成分定性犘犆犚检测方法犕犲狋犺狅犱狅犳狋犺犲狆犾狅狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狀犵犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱犮狅犿狆狅狀犲狀狋狊犻狀狆犻犿犻犲狀狋狅２００９０２２０发布２００９０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书中华人民共和国出入境检验检疫行　业　标　准青椒中转基因成分定性犘犆犚检测方法ＳＮ／Ｔ２２７１—２００９中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６　印张０．５　字数９千字２００９年５月第一版　２００９年５月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１９６５８　定价１４．００元食品伙伴网书书书前　　言　　本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、刘心同、王岩、于立欣、曹忠雷。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２７１—２００９食品伙伴网青椒中转基因成分定性犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了转基因青椒中外源基因ＣａＭＶ３５Ｓ、ＮＰＴⅡ、ＮＯＳ、ＣＭＶ定性ＰＣＲ检测方法。本标准适用于对青椒样品的转基因筛选检测，适用于抗黄瓜花叶病毒转基因青椒的鉴定。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１２０４　植物及其加工品中转基因成分实时荧光ＰＣＲ检测方法３　术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。３．１　术语和定义３．１．１　转基因　狋狉犪狀狊犵犲狀犲将本物种不具有的、来源于其他物种的功能ＤＮＡ序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。３．１．２聚合酶链反应　狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀，犘犆犚模板基因序列先经过高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别于模板ＤＮＡ两条链上的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的催化下以四种脱氧核糖核苷酸（ｄＮＴＰ）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。３．２　缩略语３．２．１狉犫犮犔　狉犻犫狌犾狅狊犲犫犻狊狆犺狅狊狆犺犪狋犲犮犪狉犫狅狓狔犾犪狊犲／狅狓狔犵犲狀犪狊犲犾犪狉犵犲狊狌犫狌狀犻狋核酮糖１，５二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基基因，由植物叶绿体基因组编码。３．２．２犆犪犕犞３５犛　３５狆狉狅犿狅狋犲狉犳狉狅犿犮犪狌犾犻犳犾狅犿犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子。３．２．３犖犘犜Ⅱ　狀犲狅犿狔犮犻狀狆犺狅狊狆犺狅狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲Ⅱ新霉素３’磷酸转移酶。３．２．４犖犗犛　狀狅狆犪犾犻狀犲狊狔狀狋犺犪狊犲狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉胭脂碱合成酶３’转录终止子。１犛犖／犜２２７１—２００９食品伙伴网３．２．５犆犕犞　犮狌犮狌犿犫犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊黄瓜花叶病毒。４　原理样品经过提取ＤＮＡ后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过ＰＣＲ技术，特异性扩增外源基因的ＤＮＡ片段，根据ＰＣＲ扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分。检测先对提取的ＤＮＡ进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性，再进行鉴定基因的检测。如果筛选基因为阴性则直接报告结果。检测过程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的规定执行。５　试剂５．１　犘犆犚用引物按照表１中提供的引物序列合成引物，加入无离子水配成１００ｐｍｏｌ／μＬ贮存，配成直接用于ＰＣＲ反应的１０ｐｍｏｌ／μＬ的工作液。表１　转基因青椒犘犆犚检测用的引物序列及犘犆犚产物的大小引物名称类　型引物序列片段／ｂｐ用　途ｒｂｃＬ内源Ｆ　５’ａａｔｃｔｔｃｔａｃｔｇｇｔａｃａｔｇｇａｃ３’Ｒ　５’ｔｃａｔｃａｔｃｔｔｔｇｇｔａａａａｔｃａａｇ３’４３３内对照ＣａＭＶ３５Ｓ外源Ｆ　５’ｇｃｔｃｃｔａｃａａａｔｇｃｃａｔｃａ３’Ｒ　５’ｇａｔａｇｔｇｇｇａｔｔｇｔｇｃｇｔｃａ３’１９５筛选ＮＯＳ外源Ｆ　５’ｇａａｔｃｃｔｇｔｔｇｃｃｇｇｔｃｔｔｇ３’Ｒ　５’ｔｔａｔｃｃｔａｇｔｔｔｇｃｇｃｇｃｔａ３’１８０筛选ＮＰＴⅡ外源Ｆ　５’ａｃｃｔｇｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇａａｔｇａａｃｔｇｃ３’Ｒ　５’ｇｃｃａｔｇａｔｇｇａｔａｃｔｔｔｃｔｃｇｇｃａｇｇａｇｃ３’１９６筛选ＣＭＶ外源Ｆ　５’ａａｇａｃｇｔｔｇｇｃａｇｃｔｇｇｔｃｇ３’Ｒ　５’ｃｔｃｇａａｔｔｔｇａａｔｇｃｇｃｇａａ３’２０２鉴定５．２　药品及试剂犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，琼脂糖（电泳纯）溴化乙锭，三氯甲烷，异丙醇，７０％乙醇，分子量标准（１００ｂｐ～２０００ｂｐ），ＲＮａｓｅＡ酶，Ｔｒｉｓ饱和酚，ＵＮＧ酶。ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。１０×ＰＣＲ缓冲液：１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，１６０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵［（ＮＨ４）２ＳＯ４］，２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁（ＭｇＳＯ４），２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８），１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ。电泳缓冲液：Ｔｒｉｓ５４ｇ，硼酸２７．５ｇ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ＋ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）２０ｍＬ，加蒸馏水至１０００ｍＬ；使用时１０倍稀释。溴化乙锭贮存液：用双蒸水配制成１０ｍｇ／ｍＬ。ｄＮＴＰｓ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ。ＣＴＡＢ提取缓冲液：１％ＣＴＡＢ，０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．７ｍｏｌ／Ｌ氯化钠（ＮａＣｌ），０．０１ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。６　仪器固体粉碎机或研钵，高速冷冻离心机，台式小型离心机，Ｍｉｎｉ个人离心机，天平（感量０．００１ｇ）旋涡２犛犖／犜２２７１—２００９食品伙伴网振荡器，ＰＣＲ仪，电泳仪，超净工作台，核酸蛋白分析仪，微量移液器，凝胶成像系统，离心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，１．５ｍＬ～５ｍＬ），ＰＣＲ反应管（２００μＬ～５００μＬ）。７　检测方法７．１　样品犇犖犃的提取与纯化称取１００ｍｇ样品至１．５ｍＬ离心管中，加入７００μＬＣＴＡＢ提取缓冲液，涡旋振荡混匀后于６５℃温育３０ｍｉｎ，期间颠倒混匀离心管２次～３次。加入７００μＬ的等体积三氯甲烷∶异戊醇，涡旋振荡混匀后放置１０ｍｉｎ，期间颠倒混匀离心管２次～３次；１２０００犵离心５ｍｉｎ。转移上清液至１．５ｍＬ离心管中。加入０．６倍体积经４℃预冷的异丙醇，于－２０℃下静置５ｍｉｎ，１２０００犵离心５ｍｉｎ，小心弃去上清液；加入１０００μＬ７０％乙醇，期间颠倒混匀离心管２次～３次，４℃下８０００犵离心１ｍｉｎ，小心弃去上清液；加２０μＬＲＮａｓｅＡ酶（１０μｇ／ｍＬ），３７℃温育３０ｍｉｎ。加入６００μＬ氯化钠溶液，６５℃温浴１０ｍｉｎ。加入６００μＬ的三氯甲烷／Ｔｒｉｓ饱和酚，颠倒混匀后，１２０００犵离心５ｍｉｎ，转移上层水相至１．５ｍＬ离心管中。加入０．６倍体积经４℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于４℃下静置３０ｍｉｎ；４℃下１２０００犵离心１０ｍｉｎ，小心弃去上清液；加入１０００μＬ经４℃预冷的７０％乙醇，期间颠倒混匀离心管２次～３次，４℃下１２０００犵离心１０ｍｉｎ，小心弃去上清液；用经４℃预冷的７０％乙醇按相同方法重复洗一次。冷冻干燥系统中挥干液体；加５０μＬＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ，４℃保存备用。７．２　犘犆犚扩增７．２．１　实验对照的设立每个样品应有２个平行实验，同时每次检测应设立３个对照：———分子量标准；———阳性对照，为包含要检测基因片段的转基因植物材料的ＤＮＡ或包含要检测基因片段的阳性质粒ＤＮＡ；———阴性对照，非转基因青椒基因组ＤＮＡ；———空白对照（不含ＤＮＡ模板）。７．２．２　犘犆犚反应体系在２００μＬＰＣＲ反应管中，按表２所列顺序依次加入反应物，总体积为２５μＬ。表２　犘犆犚反应体系组成成分组成成分２５μＬ反应体积１０×ＰＣＲ缓冲液２．５μＬ４×ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，含ｄＵＴＰ）２．０μＬ引物１（１０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ引物２（１０ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬＵＮＧ酶（１Ｕ／μＬ）０．２μＬ氯化镁（ＭｇＣｌ２）（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬＤＮＡ模板０．５μＬ～２．０μＬ（１０ｎｇ～５０ｎｇＤＮＡ）无离子水使反应体积达到２５μＬ７．２．３　犘犆犚反应程序不同外源基因的具体扩增程序见表３。犛犖／犜２２７１—２００９食品伙伴网书书书犛犖／犜２２７１—２００９表３　犘犆犚反应条件参数被扩增的外源基因变　性扩　增循环次数最终延伸ｒｂｃＬＣａＭＶ３５ＳＮＯＳＮＰＴⅡＣＭＶ９４℃，３ｍｉｎ９４℃，４０ｓ５４℃，４５ｓ７２℃，４５ｓ３５７２℃，７ｍｉｎ７．３　犘犆犚扩增产物的凝胶电泳检测称取２．０ｇ琼脂糖，于１００ｍＬ电泳缓冲液（０．５×ＴＢＥ）中，用微波炉加热溶解琼脂糖，冷却至５５℃～６０℃左右加入溴化乙锭（ＥＢ）至终浓度为０．５μｇ／ｍＬ，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液（０．５×ＴＢＥ），使液面刚刚没过凝胶。将８μＬ～１０μＬＰＣＲ扩增产物和２μＬ加样缓冲液混合，点样。每行胶孔中选一个胶孔，在其中加入ＤＮＡ分子量标记以判断ＰＣＲ扩增产物大小。电压大小一般控制在３Ｖ／ｃｍ～５Ｖ／ｃｍ，电泳时间约３５ｍｉｎ，或者根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳结果用凝胶成像仪记录并保存。８　结果判定８．１　判断提取的犇犖犃质量使用内参照引物ｒｂｃＬ扩增样品的ＤＮＡ，如果阴性对照、样品和阳性对照的ＰＣＲ产物都出现４３３ｂｐ的条带，则表明提取的样品ＤＮＡ符合ＰＣＲ反应的要求，可以用于外源基因检测；否则不能用于检测外源基因，应该重新提取样品ＤＮＡ。８．２　筛选基因的判定使用筛选基因的引物ＣａＭＶ３５Ｓ、ＮＯＳ、ＮＰＴⅡ对样品ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带，则可以初步判断该样品含有外源基因，应该进一步进行确证实验，依照确证实验的结果最终报告。如果阴性对照和样品都未出现扩增的ＰＣＲ产物，而阳性样品出现扩增的ＰＣＲ产物，则可以判断待测样品中不含有该外源基因。８．３　鉴定基因判定对于青椒中转基因成分的检测，先检测ＣａＭＶ３５Ｓ、ＮＯＳ、ＮＰＴⅡ基因。如果检测结果阴性则报告结果。如果检测结果阳性，则进行鉴定检测ＣＭＶ基因，以确定转基因青椒的为抗黄瓜花叶病毒的转基因青椒。９　确证实验确证实验方法按照ＳＮ／Ｔ１２０４中规定的方法执行。９００２—１７２２犜／犖犛书号：１５５０６６·２１９６５８定价：　　１４．００元食品伙伴网