SNT 2154-2008 进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法 兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１５４—２００８进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮狅犪犵狌犾犪狊犲狆狅狊犻狋犻狏犲狊狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮犻犻狀犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱—犜犲犮犺狀犻狇狌犲狌狊犻狀犵狉犪犫犫犻狋狆犾犪狊犿犪犳犻犫狉犻狀狅犵犲狀犪犵犪狉犿犲犱犻狌犿２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准中直接平板计数法参照了ＩＳＯ６８８８２《食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法　第２部分：兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术》［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｆｏｏｄａｎｄａｎｉｍａｌｆｅｅｄｉｎｇｓｔｕｆｆｓ—Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｏａｇｕｌａｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅ狊狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮犻（狊狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊犪狌狉犲狌狊ａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ）—Ｐａｒｔ２：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｕｓｉｎｇｒａｂｂｉｔｐｌａｓｍａｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎａｇａｒｍｅｄｉｕｍ］，ＭＰＮ法参照了ＩＳＯ６８８８３《食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法　第３部分：ＭＰＮ检测技术》［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｆｏｏｄａｎｄａｎｉｍａｌｆｅｅｄｉｎｇｓｔｕｆｆｓ—Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｏａｇｕｌａｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ）—Ｐａｒｔ３：ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＭＰＮｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｌｏｗｎｕｍｂｅｒｓ］。本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：赵贵明、刘沛、李卫华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１５４—２００８进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术１　范围本标准规定了进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法。本标准中直接平板计数法适用于食品中凝固酶阳性葡萄球菌的计数，ＭＰＮ法适用于凝固酶阳性葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。动物饲料等其他食品可参照执行。２　设备和材料２．１　灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅和干热灭菌箱。２．２　水浴箱：４８℃±１℃。２．３　培养箱：３６℃±１℃。２．４　吸管：１ｍＬ和１０ｍＬ，分刻度分别为０．０１ｍＬ和０．１ｍＬ。２．５　接种环：３ｍｍ直径。２．６　天平：量程２ｋｇ，灵敏度０．１ｇ。２．７　灭菌样品处理器具：取样勺，剪刀，开罐器等。２．８　样品稀释瓶：２５０ｍＬ、５００ｍＬ。２．９　无菌培养皿：直径９０ｍｍ。２．１０　均质器。２．１１　无菌试管。２．１２　酒精灯或煤气灯。２．１３　ｐＨ计。２．１４　金黄色葡萄球菌（凝固酶阳性）标准质控菌株：ＡＴＣＣ２７２１７或其他来源的经验证合格的菌株。３　培养基和试剂３．１　兔血浆纤维蛋白原（ＲＰＦ）琼脂培养基（见附录Ａ第Ａ．１章）。３．２　改良ＧＣ肉汤（ｍｏｄｉｆｉｅｄＧｉｏｌｉｔｔｉａｎｄＣａｎｔｏｎｉｂｒｏｔｈ，见附录Ａ第Ａ．２章）。３．３　水琼脂（见附录Ａ第Ａ．３章）。３．４　蛋白胨氯化钠溶液（见附录Ａ第Ａ．４章）。第一法　直接平板计数法４　检验程序检验程序见图１。１犛犖／犜２１５４—２００８图１　凝固酶阳性葡萄球菌直接平板计数法检验程序５　操作步骤５．１　样品的制备５．１．１　样品的整个制备过程均应遵循无菌操作程序。５．１．２　冷冻样品检验前可在０℃～４℃条件下解冻，时间不超过１８ｈ，也可在温度不超过４５℃的条件解冻，时间不超过１５ｍｉｎ。５．１．３　液体样品应先将其充分摇匀。５．２　样品匀液的制备５．２．１　固体和半固体食品：以无菌操作称取２５ｇ样品，于盛有２２５ｍＬ蛋白胨氯化钠溶液的无菌均质杯内，于８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０样品匀液；或于装有２２５ｍＬ蛋白胨氯化钠溶液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ制成１∶１０的样品匀液。５．２．２　液体样品：以无菌吸管吸取样品２５ｍＬ放入装有２２５ｍＬ蛋白胨氯化钠溶液的无菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成１∶１０的样品匀液。５．２．３　用１０ｍＬ无菌吸管或微量移液器吸取１∶１０样品匀液１０ｍＬ，沿管壁缓慢注于装有９０ｍＬ稀释液的无菌三角瓶中，振摇均匀或换用１支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成１∶１００的样品匀液。如需进一步稀释，按上述顺序操作。５．３　接种及培养５．３．１　根据对样品污染情况的估计，选择３个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做１０倍递增稀释的同时，吸取１ｍＬ样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。５．３．２　样品匀液移入平皿后，应及时将凉至４８℃左右的ＲＰＦ琼脂培养基（可放置于４８℃±１℃恒温水浴箱中保温）注入平皿约１５ｍＬ～２０ｍＬ，并转动平皿使混合均匀。同时将ＲＰＦ琼脂培养基倾入加２犛犖／犜２１５４—２００８有１ｍＬ空白稀释液的无菌平皿内作对照。５．３．３　待琼脂凝固后，翻转平板，置３６℃±１℃培养箱，培养２４ｈ～４８ｈ。５．４　典型菌落计数５．４．１　凝固酶阳性葡萄球菌在ＲＰＦ琼脂培养基平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环。注：菌落色泽与葡萄球菌还原亚碲酸钾的能力相关，大部分金黄色葡萄球菌形成黑色或灰色菌落，其他不还原亚碲酸钾的葡萄球菌则为白色菌落。凝固酶阳性的葡萄球菌产生的凝固酶将纤维蛋白原分解为不溶性纤维蛋白，使菌落外围出现沉淀晕环。５．４．２　选择菌落数在１５～３００之间的平板，挑典型菌落计数（见５．４．１描述），按平均典型菌落数乘以稀释倍数计算。５．４．３　若有两个连续稀释度在适宜计数范围内时，按式（１）计算：犖＝∑犆（狀１＋０．１狀２）犱…………………………（１）　　式中：犖———样品中菌落数；∑犆———平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；狀１———适宜范围菌落数的第一稀释度（低）平板个数；狀２———适宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板个数；犱———稀释因子（适宜范围菌落数的第一稀释度）。示例：稀释度１∶１００（第一稀释度）１∶１０００（第二稀释度）菌落数６６，５４４，７　　　　　　　　　　　　犖＝∑犆（狀１＋０．１狀２）犱＝（６６＋５４＋４＋７）／［（１×２＋０．１×２）×１０－２］＝５９５５上述数据经“四舍五入”后，表示为６０００或６．０×１０３。５．４．４　若所有稀释度的平板菌落数均小于１５，则应按最低稀释度的平均典型菌落数乘以稀释倍数计算。５．４．５　若所有稀释度（包括液体样品原液）的平板均无典型菌落生长，则以小于１乘以最低稀释倍数计算。６　凝固酶阳性葡萄球菌菌落总数的报告６．１　菌落数在１００以内时，按“四舍五入”方式修约，采用两位有效数字报告。６．２　大于或等于１００时，前第３位数字采用“四舍五入”方式修约后，取前２位数字，后面用０代替位数来表示结果；也可用１０的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”方式修约，采用两位有效数字。６．３　若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。６．４　固体或半固体样品以ＣＦＵ／ｇ为单位报告结果，液体样品以ＣＦＵ／ｍＬ为单位报告结果。第二法　犕犘犖法７　检验程序检验程序见图２。３犛犖／犜２１５４—２００８图２　凝固酶阳性葡萄球菌犕犘犖法检验程序８　操作步骤８．１　接种及培养８．１．１　分别在做１０倍递增稀释的同时，选择适宜的３个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以吸取该稀释度的吸管或微量移液器吸取１ｍＬ样品匀液，接种到９ｍＬ改良ＧＣ肉汤管，每个稀释度接种３管，如需做双料，则应吸取１０ｍＬ样品匀液，接种到１０ｍＬ改良ＧＣ肉汤管。每个试管中均加入适量冷却至４８℃左右的无菌水琼脂或石蜡，凝固后使形成密封状态。要求样品的最高稀释度，能达到获得阴性终点。将上述接种物３６℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。８．１．２　如试管中的液体变色或出现黑色沉淀，用３ｍｍ接种环移取１环，分别划线接种ＲＰＦ琼脂培养基平板，３６℃±１℃培养，２４ｈ～４８ｈ；如试管中的液体没有产生黑色沉淀或变色，则继续培养２４ｈ±２ｈ，培养至４８ｈ后，无论试管有无变黑，均需用接种环分别划线接种ＲＰＦ琼脂培养基平板，３６℃±１℃培养，２４ｈ～４８ｈ后观察结果。注：接种环移取肉汤培养物前，先无菌去除水琼脂或石蜡层。８．２　典型菌落确认凝固酶阳性葡萄球菌在ＲＰＦ平板上呈黑色或灰色，甚至白色的小菌，外围有沉淀晕环。８．３　结果计算计算有典型菌落的ＲＰＦ琼脂培养基平板所对应的管数，查ＭＰＮ检索表（见附录Ｂ）。９　报告根据检索表的数值，报告样品中凝固酶阳性葡萄球菌的含量，单位：ＭＰＮ／ｇ或ＭＰＮ／ｍＬ。４犛犖／犜２１５４—２００８附　录　犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１　兔血浆纤维蛋白原（犚犘犉）琼脂培养基犃．１．１　成分犃．１．１．１　基础成分胰酪胨　　　　　　　　　　１０．０ｇ酵母粉１．０ｇ牛肉粉５．０ｇ丙酮酸钠１０．０ｇＬ甘氨酸１２．０ｇ氯化锂５．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水９００ｍＬ犃．１．１．２　亚碲酸钾溶液称取１ｇ亚碲酸钾，加入１００ｍＬ蒸馏水或去离子水中，通过０．２２μｍ孔径的滤膜进行过滤除菌，并于３℃±２℃保存不超过１个月，若溶液中出现白色沉淀应弃去。犃．１．１．３　牛纤维蛋白原溶液称取５ｇ牛纤维蛋白原，加入１００ｍＬ蒸馏水或去离子水中，临用时配制。犃．１．１．４　兔血浆和胰酶抑制剂溶液称取３０ｍｇ胰酶抑制剂，加入３０ｍＬ含ＥＤＴＡ的兔血浆，临用时配制。犃．１．２　制法将培养基的各个基础成分加入蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节ｐＨ７．２±０．２，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至４８℃左右备用（４８℃水浴）。无菌加入预热至４８℃左右的１％亚碲酸钾溶液２．５ｍＬ、牛纤维蛋白原溶液７５ｍＬ及兔血浆和酶抑制剂溶液２５ｍＬ，混匀后铺平板备用。该平板应立即使用，避免血浆沉淀的出现。犃．２　改良犌犆肉汤（犿狅犱犻犳犻犲犱犌犻狅犾犻狋狋犻犪狀犱犆犪狀狋狅狀犻犫狉狅狋犺）犃．２．１　成分犃．２．１．１　基础成分胰酪胨２０．０ｇ牛肉粉１０．０ｇ酵母粉１０．０ｇ氯化锂１０．０ｇ甘露醇４０．０ｇ氯化钠１０．０ｇ甘氨酸２．４ｇ丙酮酸钠６．０ｇＴｗｅｅｎ８０２．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ５犛犖／犜２１５４—２００８犃．２．１．２　亚碲酸钾溶液称取１ｇ亚碲酸钾溶于１００ｍＬ蒸馏水或去离子水中，通过０．２２μｍ孔径的滤膜进行过滤除菌，并于３℃±２℃保存不超过１个月，若溶液中出现白色沉淀应弃去。犃．２．２　制法将培养基的各个基础成分加入蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节ｐＨ６．９±０．２，适量分装，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至４８℃左右备用。无菌加入０．１ｍＬ１％亚碲酸钾溶液于每９ｍＬ单料管，０．２ｍＬ于每１０ｍＬ双料管，混匀后使用。犃．３　水琼脂称取１３．０ｇ细菌学琼脂粉于１０００ｍＬ蒸馏水或去离子中，加热煮沸至完全溶解，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至４８℃左右备用。犃．４　蛋白胨氯化钠溶液犃．４．１　成分蛋白胨０．１ｇ氯化钠８．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．４．２　制法将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节ｐＨ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，灭菌后ｐＨ７．０±０．１（２５℃）。６犛犖／犜２１５４—２００８附　录　犅（规范性附录）１犵（犿犔）检样中最近似值（犕犘犖）表表犅．１阳　性　管　数０．１０．０１０．００１ＭＰＮ０００＜３００１３００２６００３９０１０３０１１６．１０１２９．２０１３１２０２０６．２０２１９．３０２２１２０２３１６０３０９．４０３１１３０３２１６０３３１９１００３．６１０１７．２１０２１１１０３１５１１０７．３１１１１１１１２１５１１３１９１２０１１１２１１５１２２２０１２３２４１３０１６１３１