SNT 2135-2008 蜂蜜中转基因成分检测方法 普通PCR方法和实时荧光PCR方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１３５—２００８蜂蜜中转基因成分检测方法普通犘犆犚方法和实时荧光犘犆犚方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱犮狅犿狆狅狀犲狀狋狊犻狀犺狅狀犲狔—犆狅狀狋犲狀狋犻狅狀犪犾犘犆犚犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草。本标准主要起草人：饶红、冯骞、陈广全、付浦博、曾静、汪琦、张惠媛。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１３５—２００８蜂蜜中转基因成分检测方法普通犘犆犚方法和实时荧光犘犆犚方法１　范围本标准规定了蜂蜜中转基因成分的定性检测方法。本标准中适用于以转基因棉花、转基因油菜等作为蜜源植物采集的蜂蜜或受到转基因作物污染的蜂蜜中的转基因成分的检测。２　规范化引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）ＳＮ／Ｔ１１９３　基因分析检测实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１１９４　植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法３　术语、定义和缩略语３．１　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１．１聚合酶链式反应　狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀，犘犆犚体外酶催合成特异ＤＮＡ片段的方法，模板基因序列先经高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖（ｄＮＴＰ）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。３．１．２实时荧光犘犆犚　狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析的方法。ＰＣＲ扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光集团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，犜犪狇酶的５’３’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与ＰＣＲ产物形成完全同步。就是通过对ＰＣＲ扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量ＰＣＲ反应中，引入了一种荧光化学物质，随着ＰＣＲ反应的进行，ＰＣＲ反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。３．１．３定性检测　狇狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲犱犲狋犲犮狋犻狅狀对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。１犛犖／犜２１３５—２００８３．２　缩略语３．２．１　下列缩略语适用于本标准。ＧＭＯ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｏｒｇａｎｉｓｍ转基因生物。３．２．２　ＣａＭＶ３５Ｓ　３５ＳｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ．ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子。３．２．３　ＮＯＳ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｏｆｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。３．２．４　ＣＰ４ＥＰＳＰＳ　５ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ５莽草酸３磷酸合成酶基因。３．２．５　ＩＶＲ　Ｉｎｖｅｒｔａｓｅ１ｇｅｎｅｆｒｏｍｍａｉｚｅ玉米转化酶１基因。３．２．６　ＮｐｔＩＩ　ｎｅｏｍｙｃｉｎ３’ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ新霉素３’磷酸转移酶基因。３．２．７　ＣｒｙＩＡ（ｂ）：ａｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄｔｈｅｆｉｒｓｔ６４８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｅｔｒｕｎｃａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｄｅｎｔｉｃａｌｔｏｔｈａｔｏｆｃｒｙＩＡ（ｂ）ｇｅｎｅｏｆ犅犪犮犻犾犾狌狊狋犺狌狉犻狀犵犻犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．犓狌狉狊狋犪犽犻狊狋犲犪犻狀犎犇１苏云金芽孢杆菌结晶蛋白ＣｒｙＩＡ（ｂ）型毒素抗虫基因。３．２．８　ＰＡＴ　ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ草丁膦乙酰转移酶基因。３．２．９　ＢＡＲＮＡＳＥ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ来源于杆菌犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊的ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ基因。３．２．１０　ＢＡＲＳＴＡＲ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｔｈｅｂａｒｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍ犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊来源于杆菌犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊的ｂａｒｎａｓｅ基因的特异抑制基因。３．２．１１　ＰＥＰ　ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｉｌｐｙｒｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。３．２．１２　ＦＭＶ３５ｓ　３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍａｍｏｄｉｆｉｅｄｆｉｇｗｏｒｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓｇｒｏｕｐ）玄参花叶病毒３５Ｓ启动子。３．２．１３　ＢＡＲ　ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｏｒａｓｅｇｅｎｅ抗除草剂基因（Ｂａｒ）。３．２．１４　ＣｒｙＩＡ（ｂ）ＣｒｙＩＡ（ｃ）　ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｅｆｔｒｕｎｃａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｄｅｎｔｉｃａｌｔｏｔｈａｔｏｆｃｒｙＩＡ（ｂ）ｃｒｙＩＡ（ｃ）ｇｅｎｅｏｆ犅犪犮犻犾犾狌狊狋犺狌狉犻狀犵犻犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ苏云金芽孢杆菌结晶蛋白（Ｃｒｙ）Ⅰ型毒素抗虫融合基因。３．２．１５　ＧＯＸ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅ草甘麟氧化还原酶基因。３．２．１６　ＣｒｙＩＡ（ｃ）　ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｅｆｉｒｕｎｃａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｄｅｎｔｉｃａｌｔｏｔｈａｔｏｆｃｒｙＩＡ（ｃ）ｇｅｎｅｏｆ犅犪犮犻犾犾狌狊狋犺狌狉犻狀犵犻犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ苏云金芽孢杆菌结晶蛋白ＣｒｙＩＡ（ｃ）型毒素抗虫基因４　原理蜂蜜中转基因成分检测是利用外源基因与植物本身基因的不同，通过设计只能扩增外源基因中ＤＮＡ片段的引物和进行ＰＣＲ扩增，根据实验结果，判定该蜂蜜是否带有植物外源基因成分，从而判断蜂蜜中是否含有转基因成分。实时荧光ＰＣＲ检测是在常规ＰＣＲ基础上加入荧光标记探针来实现核酸定量，由于荧光探针在ＰＣＲ反应时被切割的数量与ＰＣＲ原始模板量成正相关，因此，可以通过检测荧２犛犖／犜２１３５—２００８光信号的强度来推算转基因含量。待测样品中转基因的含量是通过与用一系列已知不同含量的转基因标准品而作出的标准曲线拟合的数学模型计算得出。５　试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯和生化级试剂。实验用水均为超纯水，规格符合ＧＢ／Ｔ６６８２相关规定。５．１　ＳＤＳ提取液：１．５％ＳＤＳ，ＥＤＴＡＮａ２１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０），ＴｒｉｓＨＣｌ２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０），ＮａＣｌ５００ｍｍｏｌ／Ｌ。５．２　ＣＴＡＢ提取液：２％ＣＴＡＢ，ＥＤＴＡＮａ２２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０），ＴｒｉｓＨＣｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＣｌ１４０ｍｍｏｌ／Ｌ。５．３　ＣＴＡＢ沉淀液：０．５％ＣＴＡＢ，ＮａＣｌ４０ｍｍｏｌ／Ｌ。５．４　Ｔｒｉｓ饱和酚。５．５　三氯甲烷。５．６　异戊醇。５．７　异丙醇。５．８　７０％乙醇。５．９　氯化钠溶液：氯化钠１．２ｍｏｌ／Ｌ。５．１０　ＲＮＡ酶（１０ｍｇ／ｍＬ）。５．１１　琼脂糖。５．１２　三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）。５．１３　ＰＣＲ缓冲液。５．１４　ｄＮＴＰ。５．１５　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。５．１６　溴化乙锭（１０ｍｇ／ｍＬ）。５．１７　１００ｂｐｌａｄｄｅｒＤＮＡＭａｒｋｅｒ。５．１８　电泳缓冲液。５．１９　电泳上样缓冲液。５．２０　２ＭＥ（β巯基乙醇）。５．２１　实验用水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。６　仪器设备６．１　恒温水浴（１０℃～９５℃）。６．２　电子天平（最小精度值０．０１ｇ）。６．３　普通离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｄ或其他等效设备）。６．４　低温高速离心机（ＭｅｃｋｍａｎｍｏｄｅｌＪ２２１或其他等效设备）。６．５　制冰机。６．６　冰箱。６．７　恒温磁力搅拌器。６．８　ｐＨ计（０～１４．００ｐＨ，最小显示单位０．０１ｐＨ，１ｍＶ）。６．９　移液器（０．１μＬ～２μＬ，１μＬ～１０μＬ，２０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ，１０００μＬ～５０００μＬ）。６．１０　ＰＣＲ管（２００μＬ）。６．１１　离心管（１．５ｍＬ，２．０ｍＬ，５０．０ｍＬ）。６．１２　ＰＣＲ仪（ＰＥ９６００或其他等效设备）。３犛犖／犜２１３５—２００８６．１３　实时荧光ＰＣＲ仪（ＡＢＩ７０００或其他等效设备）。６．１４　电泳仪（０Ｖ～３００Ｖ）。６．１５　凝胶成像分析系统。６．１６　核酸蛋白分析仪。７　抽样与制样７．１　抽样按照ＳＮ／Ｔ１１９４中规定的方法执行。７．２　制样将装有蜂蜜样品的容器放置于３７℃水浴中１ｈ～２ｈ，取样时将蜂蜜搅拌均匀，使下层沉淀物与上层的液体充分混匀后再称取样品。８　蜂蜜中犇犖犃提取方法８．１　犇犖犃提取８．１．１　改良犛犇犛方法ａ）　称取蜂蜜样品１０ｇ放入有磁力搅拌子的５０ｍＬ小烧杯中，加灭菌双蒸水２０ｍＬ，４０℃恒温振荡２０ｍｉｎ，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至５０ｍＬ离心管；ｂ）　１５０００犵离心１０ｍｉｎ，迅速倒掉上清液，保留沉淀。用２ｍＬ～４ｍＬ（根据沉淀的多少）的去离子水将离心管管壁上的沉淀冲洗下来，转入２ｍＬ离心管中，１５０００犵离心１０ｍｉｎ。弃上清液，保留沉淀。若溶液体积达４ｍＬ，应分两次转入２ｍＬ离心管中，弃上清液，保留沉淀；ｃ）　加８００μＬ预热到６５℃的ＳＤＳ提取缓冲液，混匀，转入１．５ｍＬ离心管中，放入６５℃水浴锅中水浴１５ｍｉｎ；ｄ）　１５０００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液５００μＬ；ｅ）　加ＲＮａｓｅ（终浓度１０μｇ／ｍＬ），３７℃水浴３０ｍｉｎ；ｆ）　加入等体积Ｔｒｉｓ饱和酚，充分混匀；ｇ）　１３０００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液４００μＬ，加入２００μＬＴｒｉｓ饱和酚及２００μＬ三氯甲烷异戊醇（体积比，２４∶１）混匀；ｈ）　１５０００犵离心１０ｍｉｎ，取上清液３００μＬ，加入等体积三氯甲烷异戊醇（体积比，２４∶１）混匀；ｉ）　１５０００犵离心５ｍｉｎ，取上清液１５０μＬ，加入两倍体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴１０ｍｉｎ；ｊ）　１３０００犵离心５ｍｉｎ取沉淀，并用１ｍＬ７０％乙醇清洗３次；ｋ）　倒去乙醇，离心，用吸管尽可能吸去剩余乙醇。干燥后加入５０μＬ去离子水溶解ＤＮＡ。低温（－２０℃）保存。８．１．２　犆犜犃犅法ａ）　称取蜂蜜样品１０ｇ放入有磁力搅拌子的５０ｍＬ小烧杯中，加灭菌双蒸水２０ｍＬ，４０℃恒温振荡２０ｍｉｎ，使蜂蜜样品和水充分混合均匀，转移至５０ｍＬ离心管；ｂ）　１５０００犵离心１０ｍｉｎ，迅速倒掉上清液，保留沉淀。用２ｍＬ～４ｍＬ（根据沉淀的多少）的去离子水将离心管管壁上的沉淀冲洗下来，转入２ｍＬ离心管中，