SNT 2126-2008 黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１２６—２００８黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犜犻犾犾犲狋犻犪狑犪犾犽犲狉犻犆犪狊狋犾犲犫狌狉狔犪狀犱犆犪狉狉犻狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准的附录Ｃ和附录Ｄ为规范性附录，附录Ａ和附录Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：易建平、周国梁、黄国明、印丽萍。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１２６—２００８黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法１　范围本标准规定了进出境植物检疫中黑麦草腥黑穗病菌（犜犻犾犾犲狋犻犪狑犪犾犽犲狉犻）的检测和鉴定方法。本标准适用于进出境禾本科草种和粮谷类产品中黑麦草腥黑穗病菌的鉴定。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ１８０８５—２０００　植物检疫　小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法３　缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１犘犆犚　犘狅犾狔犿犲狉犪狊犲犆犺犪犻狀犚犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链式反应。３．２犇犖犃　犇犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱脱氧核糖核酸。３．３犱犖犜犘　犇犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷三磷酸。３．４犫狆　犫犪狊犲狆犪犻狉碱基对。３．５犜犪狇酶ＤＮＡ聚合酶。３．６犈犅溴化乙锭。４　原理黑麦草腥黑穗病菌（犜犻犾犾犲狋犻犪狑犪犾犽犲狉犻ＣａｓｔｌｅｂｕｒｙａｎｄＣａｒｒｉｓ）属真菌界（Ｆｕｎｇｉ），担子菌门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ），黑粉菌纲（Ｕｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ），黑粉菌目（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎａｌｅｓ），腥黑粉菌科（Ｆｉｌｌｅｔｉａｃｅａｅ），腥黑粉菌属（犜犻犾犾犲狋犻犪）。被侵染的植株结实时，种子被病菌冬孢子侵占，形成菌瘿。冬孢子形态学特征和ＰＣＲ反应特性是鉴定该种病原菌的依据。地理分布和寄主范围参见附录Ａ。５　仪器设备５．１　多功能显微镜。１犛犖／犜２１２６—２００８５．２　体视显微镜。５．３　低速离心机。５．４　往复式振荡器。５．５　干热灭菌器。５．６　高压灭菌器。５．７　ＰＣＲ仪。５．８　凝胶成像系统。５．９　实时荧光ＰＣＲ仪。５．１０　生物培养箱。５．１１　可调微量加样器（２．５μＬ～２００μＬ）。５．１２　载玻片（长×宽为２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ，厚０．８ｍｍ）。５．１３　盖玻片（１８ｍｍ×１８ｍｍ）。５．１４　网筛（孔径１００μｍ和２０μｍ）。６　药品试剂６．１　次氯酸钠溶液或漂白粉精片（化学纯）。６．２　吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）。６．３　席尔氏浮载剂（见ＧＢ／Ｔ１８０８５—２０００附录Ａ）。６．４　无荧光显微镜物镜镜头浸泡油（Ｎｄ＝１．５１６）。６．５　溴化乙锭（ＥＢ）。６．６　封片剂：指甲油或阿拉伯树胶。６．７　琼脂糖。６．８　蛋白酶Ｋ。６．９　ＲＮＡ酶。６．１０　ＥＤＴＡ（０．５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０）。６．１１　ＴＥ（ｐＨ８．０）。６．１２　ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。６．１３　无水乙醇。６．１４　酚。６．１５　三氯甲烷。６．１６　异丙醇。６．１７　异戊醇。６．１８　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。７　实验室检验７．１　样品接收接收待检样品时，应核对记录，报检号、品名、批号、原产地、样品编号、送样员姓名、接样员姓名和接样日期。７．２　制备平均样品在样品预备室内将待检样品在样品袋内充分混匀，制成平均样品，每样１ｋｇ。７．３　样品洗涤检验７．３．１　取样从平均样品中称取５０ｇ作为试验样品。２犛犖／犜２１２６—２００８７．３．２　洗涤离心试验样品倒入灭菌三角瓶内，加蒸馏水１００ｍＬ，再加吐温２０１滴～２滴，用铝铂纸或Ｐａｒａｆｉｌｍ膜封住三角烧瓶瓶口。将三角瓶放在往复式振荡器上振荡５ｍｉｎ，洗涤液经过孔径１００μｍ和２０μｍ网筛过滤，用灭菌水冲洗孔径２０μｍ网筛上的截留物，洗涤三次后将截留物转移至离心管内，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，取沉淀物。７．３．３　定容沉淀物中加入席尔氏浮载剂，定容至１ｍＬ～３ｍＬ。７．３．４　镜检用微量加样器吸取沉淀物悬浮液１５μＬ～２０μＬ至载玻片上，加盖玻片制片。在１００×显微镜下镜检，检查是否有表面呈疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子。每份试验样品的离心沉淀物至少检查５张玻片，每片按视野依次全部检查。７．４　菌瘿检查镜检发现每个玻片超过１０个具疣状突起孢壁纹饰的腥黑穗病菌冬孢子，将剩余平均样品倒入白瓷盘内，在充足光线下仔细检查有无菌瘿。受腥黑穗病菌侵染的种子被病菌穗状冬孢子代替而成为菌瘿，菌瘿位于子房内，外被一层不明显致密的寄主种皮，通常是部分受害，感染部分多数局限于种子的内稃一侧，外观症状不明显。冬孢子堆暗褐色（茶褐色，咖啡色），无明显气味。７．５　冬孢子形态测量发现腥黑穗病菌菌瘿，直接挑取少许冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。未发现腥黑穗病菌菌瘿，显微镜或解剖镜下从洗涤液中挑取冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。显微镜下观察冬孢子形态特征并随机测量３０个冬孢子的直径。每个成熟冬胞子按长短轴方向测量冬孢子直径大小，两者平均值为该冬孢子直径，并计算出３０个冬孢子的平均直径。７．６　冬孢子转移和萌发如发现菌瘿，直接用菌瘿孢子萌发，从菌瘿中取少许冬孢子萌发，加入１００μＬ灭菌水，制成孢子悬浮液，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至３％水琼脂平板上，２２℃连续光照条件下培养，培养３ｄ后每天检查有无冬孢子萌发。如未发现菌瘿，７．３．４中镜检发现有孢壁纹饰为疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子，重新取样按７．３．１和７．３．２洗涤，用灭菌水悬浮沉淀物，取５０μＬ～１００μＬ沉淀物悬浮液在载玻片涂片，置显微镜５０×或解剖镜３０×下用细的挑针将冬孢子转移至无菌的塑料培养皿内的灭菌水中，挑取３０个以上的冬孢子，然后在解剖镜下用０．２５％的次氯酸钠溶液１００μＬ表面消毒１ｍｉｎ，用移液器吸去次氯酸钠溶液，再用灭菌水洗涤三次，最后加入１００μＬ～２００μＬ灭菌水，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至３％水琼脂平板上，培养和检查方法同前。７．７　菌丝培养萌发的冬孢子转移至ＰＤＡ培养基上２２℃连续光照条件下培养，７ｄ～１０ｄ后收集菌丝。７．８　犇犖犃提取菌丝液氮研磨后取５０ｍｇ～１００ｍｇ提取ＤＮＡ，提取方法可以参见附录Ｂ，也可用提取真菌或植物组织的ＤＮＡ提取试剂盒。７．９　犘犆犚检测７．９．１　菌丝培养物的犘犆犚检测７．９．１．１　引物和扩增扩增引物为Ｗ１／Ｗ４，引物序列见附录Ｃ，ＰＣＲ反应体系为：ＰＣＲ反应总体积为３０μＬ，包含：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ；５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ（ｐＨ８．３）；１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２；ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ；引物浓度１００ｎｍｏｌ／Ｌ（引物Ｕ２／Ｕ１０为１６０ｎｍｏｌ／Ｌ）；１０ｎｇ～２０ｎｇ模板ＤＮＡ：０．５Ｕ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，设阳性、阴性和空白对照，阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝ＤＮＡ，阴性为小麦印３犛犖／犜２１２６—２００８变腥黑穗病菌菌丝ＤＮＡ，空白对照为灭菌双蒸水代替ＤＮＡ膜板。加双蒸水至终体积为３０μＬ，混匀离心，置于ＰＣＲ仪进行扩增。反应循环参数为９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；最后２℃３ｍｉｎ。７．９．１．２　琼脂糖凝胶电泳取扩增产物１０μＬ，加入３μＬ上样缓冲液［０．２５％溴酚蓝，４０％（质量浓度）蔗糖水溶液］，混匀，１．５％琼脂糖凝胶电泳。电泳，ＥＢ染色（或类似染料，比如ｇｏｌｄｖｉｅｗ）后于凝胶成像仪中成像存盘。７．９．２　冬孢子的犘犆犚检测７．９．２．１　冬孢子的扩增前处理解剖镜２０×～３０×下将单个冬孢子挑至已灭菌的盖玻片小块（１ｍｍ２～２ｍｍ２）上，用另一块小玻片盖住冬孢子，用小镊子轻轻按压小玻片使孢子破裂，将两块小玻片连同破的孢子一起转移进ＰＣＲ反应管中，加入ＰＣＲ混和液，进行扩增。每个样品至少处理１２个完整冬孢子，每个处理一个冬孢子。７．９．２．２　引物和扩增第一轮扩增引物为Ｕ２／Ｕ１０和Ｔｉ１１／Ｔｉ１４，引物序列见附录Ｃ，引物比例为Ｕ２／Ｕ１０和Ｔｉ１１／Ｔｉ１４＝１．６∶１．６∶１∶１，ＰＣＲ反应体系和反应循环参数同７．９．１．１，反应循环数为２５。设阳性、阴性和空白对照，阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝ＤＮＡ，阴性为小麦印度腥黑穗病菌菌丝ＤＮＡ，空白对照为灭菌双蒸水。取第一轮扩增产物１μＬ为第二轮ＰＣＲ反应的模板进行扩增，Ｗ１／Ｗ４为第二轮ＰＣＲ引物，ＰＣＲ反应体系和反应循环参数同７．９．１．１。７．９．２．３　实时荧光犘犆犚扩增同时取第一轮扩增产物１μＬ为实时荧光ＰＣＲ反应的模板进行扩增，引物和探针序列见附录Ｃ，实时荧光ＰＣＲ扩增体系２５μＬ：５×ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ缓冲液（Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ）５μＬ，Ｍｇ２＋溶液（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（各１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．７５μＬ，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，上、下游引物（ＤＦＰ和ＴＲＰ）（１０μｍｏｌ／Ｌ）各０．５μＬ，探针ＴＷＡＬ（５μｍｏｌ／Ｌ）０．６μＬ，ＤＮＡ模板１．０μＬ，超纯水补至２５μＬ，设阳性、阴性和空白对照。实时荧光ＰＣＲ扩增在ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００定量ＰＣＲ扩增仪或其他实时荧光ＰＣＲ扩增仪上进行。两步法扩增反应程序：５０℃２ｍｉｎ，预变性９５℃１０ｍｉｎ；然后９５℃１５ｓ，６５℃１ｍｉｎ循环４０次。７．９．２．４　琼脂糖凝胶电泳电泳和观察结果同７．９．１．２。８　鉴定特征８．１　冬孢子形态学特征冬孢子球形至近球形，浅黄至暗红褐色，不透明至半透明，２３．７μｍ～４４．０μｍ（平均３４．０μｍ）。外胞壁具锥形至平截状突起，３μｍ～６μｍ高，表面观为粗糙，不完全脑纹状至珊瑚状，外被透明至微黄褐色胶质鞘，延伸至突起顶部。黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较见附录Ｄ。８．２　冬孢子萌发生理特性冬孢子２０℃～２５℃下培养２ｄ～５ｄ以后萌发，冬孢子萌发长出先菌丝，先菌丝上产生末端稍卷曲的丝状初生担孢子，数量６０～１５０，大小（３８μｍ～７５μｍ）×（１．３μｍ～１．８μｍ），平均（４４．３μｍ～６７．８μｍ）×（１．３μｍ～１．７μｍ），初生担孢子在２４ｈ内萌发，强力弹射出腊肠状次生担孢子，次生担孢子可以萌发产生次生担孢子或菌丝，菌丝又可以产生丝状次生担孢子，在初生担孢子和次生担孢子彼此之间没有融合现象。腊肠状次生担孢子大小（１０．６μｍ～１７．６μｍ）×（１．８μｍ～３．１μｍ），丝状次生担孢子大小（２６μｍ～５７．２μｍ）×（１．８μｍ～２．６μｍ）。９　结果评定９．１　发现菌瘿发现菌瘿，寄主为黑麦草属，冬孢子形态特征与８．１相符合，判定为黑麦草腥黑穗病菌。４犛犖／犜２１２６—２００８９．２　未发现菌瘿根据冬孢子形态特征不能鉴定以ＰＣＲ扩增结果为准，菌丝的ＰＣＲ、孢子的巢式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）和实时荧光ＰＣＲ试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。未发现菌瘿，根据冬孢子形态特征不能鉴定的视ＰＣＲ扩增结果，菌丝的ＰＣＲ、孢子的套式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）和实时荧光ＰＣＲ试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。１０　样品保存保存样品应按报检号、品种、批号分别存放，每样１ｋｇ。保存样品经登记和经手人签字后置低温干燥、防虫防鼠处妥善保存３个月。如发现病菌冬孢子，该样品至少保存１２个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌处理。５犛犖／犜２１２６—２００８附　录　犃（资料性附录）黑麦草腥黑穗病菌地理分布和寄主范围犃．１　地理分布美国、澳大利亚和新西兰等。