SNT 2062-2008 进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法 液相色谱串联质谱法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０６２—２００８进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法　液相色谱串联质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犪犮狉狅犾犻犱犲犪狀狋犻犫犻狅狋犻犮狊狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准的附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｃ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：谢文、丁慧瑛、奚君阳、钱艳、陈笑梅、黄雷芳。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０６２—２００８进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法　液相色谱串联质谱法１　范围本标准规定了蜂王浆中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素残留量的制样和液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素残留量的检测。２　方法提要样品用甲醇沉淀蛋白质，在磷酸盐缓冲盐溶液介质下，再用Ｃ１８固相萃取小柱净化，液相色谱串联质谱测定，外标法定量。３　试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。３．１　乙腈：高效液相色谱级。３．２　甲醇：高效液相色谱级。３．３　甲酸：高效液相色谱级。３．４　氢氧化钠。３．５　磷酸二氢钠。３．６　０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取４ｇ氢氧化钠，并用水稀释至１Ｌ。３．７　甲醇水溶液：甲醇水（２＋８，体积比）。３．８　磷酸盐缓冲溶液：溶解１３．８ｇ磷酸二氢钠于９５０ｍＬ水中，用０．１ｍｏＬ／Ｌ氢氧化钠溶液调节溶液ｐＨ值到８．０，最后用水稀释至１Ｌ。３．９　螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素磷酸盐、泰乐菌素酒石酸盐、红霉素、罗红霉素、交沙霉素标准品：纯度大于等于９５％，参见附录Ａ表Ａ．１。３．１０　７种大环内酯标准储备溶液：称取适量标准品（３．９），分别用甲醇溶解，溶液浓度为１００μｇ／ｍＬ，１℃～４℃冰箱保存。有效期三个月。３．１１　标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ的混合标准工作溶液，相当于样品中含有５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ大环内酯。３．１２　Ｃ１８固相萃取小柱，５００ｍｇ或相当者，使用前依次用５ｍＬ甲醇，５ｍＬ水预洗。４　仪器和设备４．１　高效液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源。４．２　旋转蒸发器。４．３　固相萃取装置。４．４　高速离心机：７０００ｒ／ｍｉｎ。４．５　ｐＨ计。１犛犖／犜２０６２—２００８４．６　旋涡混合器。４．７　氮吹仪。５　试样制备与保存取５００ｇ代表性蜂王浆样品，在室温下解冻，等样品全部融化后搅匀，将试样均分成两份，分别装入样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在－１８℃保存。在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。６　测定步骤６．１　提取称取２ｇ试样（精确到０．０１ｇ）置于５０ｍＬ具塞离心管中，加５ｍＬ水，混匀，静置５ｍｉｎ，再加甲醇至１０．０ｍＬ，于旋涡混合器上以２０００ｒ／ｍｉｎ混匀１ｍｉｎ，于６０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，过滤，移取５．０ｍＬ滤液，加１５ｍＬ磷酸盐缓冲溶液（３．８）稀释，混匀。６．２　净化将溶液转移至固相萃取小柱中（３．１２），再用５ｍＬ水和５ｍＬ甲醇水溶液（３．７）依次洗涤浓缩瓶，洗涤液过固相萃取小柱，弃去流出液，在负压下抽干，用６ｍＬ甲醇洗脱，控制流速１ｍＬ／ｍｉｎ～２ｍＬ／ｍｉｎ，收集全部洗脱液于１０ｍＬ离心管中，洗脱液在５０℃以下水浴下平缓氮气吹至约１ｍＬ，用水定容至２．０ｍＬ，混匀，溶液过０．４５μｍ，滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。６．３　测定６．３．１　液相色谱串联质谱条件ａ）　色谱柱：Ｃ８柱，５μｍ，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ（内径）或相当者：ｂ）　流动相梯度洗脱程序（见表１）；表１　梯度洗脱程序时间／ｍｉｎ乙腈／％０．１５％甲酸水溶液／％０２０８０２２０８０７．５８０２０７．６９５５８．７９５５８．８２０８０１４２０８０　　ｃ）　流速：４００μＬ／ｍｉｎ；ｄ）　进样量：２０μＬ；ｅ）　离子源：电喷雾离子源；ｆ）　扫描方式：正离子扫描：ｇ）　检测方式：多反应监测；ｈ）　雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件参见附录Ｂ表Ｂ．１；ｉ）　监测离子对（ｍ／ｚ）：螺旋霉素８４３．６／１７４．３（定量离子）、８４３．６／３１８．５；替米考星８６９．７／１７４．４（定量离子）、８６９．７／１５６．６；竹桃霉素６８８．６／１５８．４（定量离子）、６８８．６／５４４．６；泰乐菌素９１６．５／１７４．２（定量离子）、９１６．５／７７２．７；红霉素７３４．６／１５８．５（定量离子）、７３４．６／５７６．５；罗红霉素８３７．６／１５８．４（定量离子）、８３７．６／６７９．６；交沙霉素８２８．８／１７４．３（定量离子）８２８．８／２２９．３。２犛犖／犜２０６２—２００８６．３．２　液相色谱串联质谱测定根据试样中被测样液的含量情况，选取待测物的响应值在仪器线性响应范围内的浓度进行测定，如超出仪器线性响应范围应进行稀释。在上述色谱条件下螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素的参考保留时间分别约为９．２ｍｉｎ、９．６ｍｉｎ、１０．０ｍｉｎ、１０．２ｍｉｎ、１０．１ｍｉｎ、１０．６ｍｉｎ和１１．０ｍｉｎ，标准溶液的选择性离子流图参见附录Ｃ中图Ｃ．１。６．３．３　液相色谱串联质谱确证按照液相色谱串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中待测物质的保留时间偏差在±２．５％之内。定量测定时采用标准曲线法测定。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表２规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表２　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０允许的相对偏差／％±２０±２５±３０±５０６．３．４　空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。７　结果计算和表述用色谱数据处理机或按式（１）计算试样中大环内酯的残留含量，计算结果需扣除空白值：犡犻＝犮犻×犞犿…………………………（１）　　式中：犡犻———试样中大环内酯类抗生素残留量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮犻———从标准曲线上得到的大环内酯类抗生素残留量的溶液浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———最终样液代表的试样质量，单位为克（ｇ）。８　方法的测定低限（犔犗犙）和回收率８．１　测定低限大环内酯类抗生素残留量测定低限为１０μｇ／ｋｇ。８．２　回收率回收率见表３。表３　回收率的实验数据（在不同添加浓度范围内）化合物添加浓度／（μｇ／ｋｇ）回收率范围／％螺旋霉素１０７４．９～１０５．０２０７２．０～１０２．０１００７３．５～１０５．３替米考星１０７４．９～１００．４２０７７．０～１０５．５１００７２．３～１０３．２竹桃霉素１０７１．６～１０２５．２２０７２．５～１０２．０１００７３．９～１０５．３３犛犖／犜２０６２—２００８表３（续）化合物添加浓度／（μｇ／ｋｇ）回收率范围／％泰乐菌素１０７０．１～１００．２２０７２．５～１００．５１００７４．３～１００．３红霉素１０７２．７～１０４．１２０７６．５～１０６．５１００７８．９～１０６．４罗红霉素１０７２．５～１０２．６２０７４．５～１０９．５１００７１．０～１０５．３交沙霉素１０８０．１～１０４．５２０７１．５～１０２．５１００７３．２～１０４．３４犛犖／犜２０６２—２００８附　录　犃（资料性附录）大环内酯标准品信息表犃．１　７种大环内酯标准品信息标准物质英文名称ＣＡＳＮＯ．分子式螺旋霉素Ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ８０２５８１８Ｃ４３Ｈ７４Ｎ２Ｏ１４替米考星Ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ１０８０５０５４０Ｃ４６Ｈ８０Ｎ２Ｏ１３竹桃霉素磷酸盐Ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ７０６０７４４Ｃ３５Ｈ６１ＮＯ１２×Ｈ３ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ泰乐菌素酒石酸盐Ｔｙｌｏｓｉｎｔａｒｔｒａｔｅ７４６１０５５２Ｃ５０Ｈ８３ＮＯ２３红霉素Ａ二水合物Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ５９３１９７２１Ｃ３７Ｈ６７ＮＯ１３罗红霉素Ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ８０２１４８３１Ｃ４１Ｈ７６Ｎ２Ｏ１５交沙霉素Ｊｏｓａｍｙｃｉｎ１６８４６２４５Ｃ４２Ｈ６９ＮＯ１５５犛犖／犜２０６２—２００８附　录　犅（资料性附录）犃犘犐４０００犔犆犕犛／犕犛系统电喷雾离子源参考条件１）　　离子源参考条件：ａ）　电喷雾电压（ＩＳ）：４８００Ｖ；ｂ）　雾化气压力（ＧＳＩ）：２６２．０１ｋＰａ（３８Ｐｓｉ）；ｃ）　气帘气压力（ＣＵＲ）：１８６．１６５ｋＰａ（２７Ｐｓｉ）；ｄ）　辅助气流速（ＧＳ２）：３１０．２７５ｋＰａ（４５Ｐｓｉ）；ｅ）　离子源温度（ＴＥＭ）：５４０℃；ｆ）　碰撞气（ＣＡＤ）：４１．３７ｋＰａ（６Ｐｓｉ）；ｇ）　离子对、去簇电压（ＤＰ）、碰撞气能量（ＣＥ）及碰撞室出口电压（ＣＸＰ）见表Ｂ．１。表犅．１　离子对、去簇电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压名称离子对ｍ／ｚ去簇电压（ＤＰ）／Ｖ碰撞气能量（ＣＥ）／Ｖ碰撞室出口电压（ＣＸＰ）／Ｖ螺旋霉素８４３．６／１７４．３ａ８４３．６／３１８．５１１０５０４０１４９替米考星８６９．７／１７４．４ａ８６９．７／１５６．６１２０５８６８１５１２竹桃霉素６８８．６／１５８．４ａ６８８．６／５４４．６６５４０２３１３１９泰乐菌素９１６．５／１７４．２ａ９１６．５／７７２．７９６５３４１１５红霉素７３４．６／１５８．５ａ７３４．６／５７６．５８０４０２７１３１７罗红霉素８３７．６／６７９．６ａ８３７．６／１５８．４９０４８３０１４２２交沙霉素８２８．８／１７４．３ａ８２８．８／２２９．３１０５４５４２１４　　ａ为定量离子对。１）　非商业性声明：附录表Ａ所列参数是在ＡＰＩ４０００质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。６犛犖／犜２０６２—２００８附　录　犆（资料性附录）螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素标准品选择性离子流图图犆．１　螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素（５狀犵／犿犔）的标准品的选择性离子流图７犛犖／犜２０６２—２００８犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃，犃狀狀犲狓犅犪狀犱犃狀狀犲狓犆狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲犱狅犳犮犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犪犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犪犱犿犻狀犻狊狋犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犣犺犲犼犻犪狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犿犪犻狀犾狔犱狉犪犳狋犲犱犫狔犠犲狀犡犻犲，犎狌犻狔犻狀犇犻狀犵，犑狌狀狔犪狀犵犡犻，犢犪狀犙犻犪狀，犡犻犪狅犿犲犻犆犺犲狀，犔犲犻犳犪狀犵犎狌犪狀犵．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犲狀狋狉狔犲狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲．犖狅狋犲：犜犺犻狊犈狀犵犾犻狊犺犞犲狉狊犻狅狀，犪狋狉犪狀狊犾犪狋犻狅狀犳狉