SNT 2074-2008 主要食用菌中转基因成分定性PCR检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０７４—２００８主要食用菌中转基因成分定性犘犆犚检测方法犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狋犺犲狇狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀（犘犆犚）犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狀犵犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱犮狅犿狆狅狀犲狀狋犻狀犳犪犿犻犾犻犪狉犲犱犻犫犾犲犳狌狀犵犻２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈文炳、邵碧英、江树勋、李寿崧、朱晓南、郭立新、杨婕。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０７４—２００８主要食用菌中转基因成分定性犘犆犚检测方法１　范围本标准规定了主要食用菌中转基因成分检验的抽样、制样、定性ＰＣＲ检测方法。本标准适用于对主要食用菌（杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双孢蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等）中转基因成分的检测。２　规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和实验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—１９９２，ｎｅｑＩＳＯ３６９６：１９８７）ＳＮ／Ｔ１２０４　植物及其加工产品中转基因成分实时荧光ＰＣＲ定性检验方法３　缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１犖犗犛　狀狅狆犪犾犻狀犲狊狔狀狋犺犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊来源于根癌农杆菌的胭脂碱合成酶基因。３．２犅犃犚　狆犺狅狊狆犺犻狀狅狋犺狉犻犮犻狀犪犮犲狋狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲犵犲狀犲犳狉狅犿犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊来源于杆菌犅犪犮犻犾犾狌狊犪犿狔犾狅犾犻狇狌犲犳犪犮犻犲狀狊草丁膦乙酰转移酶基因。３．３犌犝犛　β犵犾狌犮狌狉狅狀犻犱犪狊犲犵犲狀犲β葡糖醛酸酶基因（作为植物基因表达的报告基因）。３．４犖犘犜Ⅱ　狀犲狅犿狔犮犻狀３′狆犺狅狊狆犺狅狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲犵犲狀犲来自大肠杆菌Ｋ１２菌株的新霉素３′磷酸转移酶Ⅱ基因。３．５１８犛狉犇犖犃编码１８ＳｒＲＮＡ（核糖体）的ＤＮＡ。４　原理样品经过提取ＤＮＡ后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过ＰＣＲ技术，对外源基因的ＤＮＡ片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。１犛犖／犜２０７４—２００８５　试剂和材料除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．１　２％ＣＴＡＢ缓冲液：２０ｇ／ＬＣＴＡＢ，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。５．２　Ｔｒｉｓ饱和酚或水饱和酚。５．３　三氯甲烷。５．４　异戊醇。５．５　异丙醇。５．６　无水乙醇。５．７　７０％乙醇。５．８　ＴＥ溶液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）。５．９　ＲｎａｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ）。５．１０　蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）。５．１１　琼脂糖：电泳纯。５．１２　三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）。５．１３　氯化钠溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ）。５．１４　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：乙二胺四乙酸。５．１５　１０×ＰＣＲ缓冲液（含２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁）。５．１６　ｄＮＴＰｓ溶液：ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。５．１７　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。５．１８　引物：检测转基因食用菌内、外源基因的引物序列及相关信息见表１。表１　犘犆犚引物与犘犆犚产物基因名称基因来源引　物　序　列扩增长度／ｂｐ退火温度／℃提示１８ＳｒＤＮＡ内源５′ＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡ３′５′ＡＡＴＴＴＧＣＧＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡ３′１３７５４ＮＯＳ外源５′ＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡ３′５′ＡＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡＴＣＡＴＡ３′１６５５４终止子ＢＡＲ外源５′ＡＣＡＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣ３′５′ＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴＣ３′３９８５４目的基因ＧＵＳ外源５′ＧＧＴＣＡＧＴＣＣＣＴＴＡＴＧＴＴＡＣＧ３′５′ＧＴＧＴＡＧＡＧＣＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＧ３′５４５５４报告基因ＮＰＴⅡ外源５′ＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧ３′５′ＧＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＧ３′６００５４标记基因５．１９　研究转基因食用菌用的阳性质粒ｐ３０１ｂＧ１，含有终止子ＮＯＳ、香菇三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＰＤ）基因启动子、目的基因ＢＡＲ、报告基因ＧＵＳ等元件，从中提取ＤＮＡ溶液。５．２０　溴化乙锭（ＥＢ）：１０ｍｇ／ｍＬ。５．２１　ＤＮＡ分子量标准。５．２２　５×ＴＢＥ缓冲液：Ｔｒｉｓ５４ｇ，硼酸２７５ｇ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍＬ加蒸馏水至１０００ｍＬ。５．２３　６×加样缓冲液（电泳前沿指示剂）：０．２５％溴酚蓝，０．２５％二甲苯青ＦＦ，３０％甘油水溶液（或４０％蔗糖）。２犛犖／犜２０７４—２００８５．２４　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管：１．５ｍＬ，２ｍＬ两种规格，用前须高压灭菌处理。５．２５　ＰＣＲ反应管：２００μＬ，用前须高压灭菌处理。６　仪器设备６．１　研钵或电动研磨器。６．２　恒温水浴锅或干式恒温器：恒温范围为室温～１００℃，精度为±０．５℃。６．３　电子天平：感量为０．００１ｇ与０．０００１ｇ。６．４　台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。６．５　高温干燥箱。６．６　冷冻、冷藏冰箱。６．７　制冰机。６．８　旋涡振荡器。６．９　高压灭菌锅。６．１０　ｐＨ计。６．１１　微量移液器：体积范围为０．２０μＬ～２．０μＬ，２μＬ～２０μＬ，２０μＬ～２００μＬ，２００μＬ～１０００μＬ，枪头用前应高压灭菌处理。６．１２　ＤＮＡ浓缩仪。６．１３　核酸蛋白分析仪。６．１４　纯水机。６．１５　ＰＣＲ超净工作台或生物安全柜。６．１６　ＰＣＲ仪。６．１７　微波炉。６．１８　电泳仪。６．１９　电泳槽。６．２０　凝胶分析成像系统。７　测定方法７．１　犇犖犃的抽提及浓度测定７．１．１　犇犖犃的提取称取约５０ｇ烘干后的食用菌样品，经干热灭菌（１５０℃干热处理２ｈ）或１２０℃、３０ｍｉｎ高压消毒处理的研钵或在粉碎机中研磨成颗粒大小约０．５ｍｍ左右的粉末，备用。称取１００ｍｇ烘干后研磨成粉的样品于１．５ｍＬ的离心管中，加６００μＬ２％ＣＴＡＢ缓冲液，５μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ），５μＬＲｎａｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ），剧烈振荡３０ｓ以上，６５℃温浴１ｈ，期间定期振荡。加６００μＬ水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（２５∶２４∶１），剧烈振荡，１．２×１０４犵离心１５ｍｉｎ。取上清液，再加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（２５∶２４∶１），振荡混匀，１．２×１０４犵离心１５ｍｉｎ。取上清液，加０．８倍体积异丙醇，混匀，１．２×１０４犵离心１０ｍｉｎ。取沉淀，加入４００μＬ氯化钠（１ｍｏｌ／Ｌ）于６５℃温浴中溶解，加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（２５∶２４∶１），振荡，１．２×１０４犵离心１５ｍｉｎ。取上清液，加２倍体积的无水乙醇，轻微振荡，１．２×１０４犵离心１０ｍｉｎ。取沉淀，７０％乙醇清洗２次，干燥，加１００μＬＴＥ（ｐＨ８．０）溶解。每个样品设２个重复。也可使用市售的应用于真菌ＤＮＡ提取的试剂盒。７．１．２　犇犖犃的浓度与纯度测定７．１．２．１　方法１样品ＤＮＡ用核酸蛋白分析仪测定２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处吸收值，分别计算ＤＮＡ纯度与浓度，ＤＮＡ纯度等于ＯＤ２６０／ＯＤ２８０，比值在１．７～２．０之间较为理想。双链ＤＮＡ浓度（μｇ／ｍＬ）等于５０倍ＯＤ２６０值。３犛犖／犜２０７４—２００８７．１．２．２　方法２通过真核生物共有的核糖体１８ＳｒＤＮＡ基因的ＰＣＲ扩增结果，判定从样品中提取的ＤＮＡ是否适合于ＰＣＲ检测，ＰＣＲ测试步骤按７．２规定的方法。７．２　定性犘犆犚检测７．２．１　犘犆犚反应体系检测食用菌中的内源１８ＳｒＤＮＡ基因与外源基因采用的ＰＣＲ检测体系见表２。每个样品反应体系设２个重复（同时做２管）。表２　定性犘犆犚检测参考反应体系试剂名称储备液浓度２５μＬ反应体系加样量／μＬ５０μＬ反应体系加样量／μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液（含２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁）—２．５５．０ｄＮＴＰｓ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ２．５５．０犜犪狇酶５Ｕ／μＬ０．２０．４正向引物反向引物１０μｍｏｌ／Ｌ０．５１．００．５１．０ＤＮＡ模板１００ｎｇ／μＬ～２０００ｎｇ／μＬ１．０２．０双蒸水（ｄｄＨ２Ｏ）—补至２５补至５０７．２．２　犘犆犚反应体系对照的设置进行ＰＣＲ检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的ＤＮＡ。阴性对照：非转基因食用菌中提取的ＤＮＡ。空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。７．２．３　犘犆犚反应热循环参数的设置９４℃预变性２ｍｉｎ。９４℃变性３０ｓ，５４℃退火４０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，４０个循环。７２℃延伸５ｍｉｎ。４℃下保存。也可根据不同的基因扩增仪对ＰＣＲ反应热循环参数做相应的调整。７．２．４　犘犆犚扩增产物的电泳检测用０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液制备２％的琼脂糖凝胶。将８μＬ～１０μＬ的ＰＣＲ扩增产物分别与１μＬ～２μＬ的６×加样缓冲液（电泳前沿指示剂）混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子量大小适当的ＤＮＡＭａｒｋｅｒ做分子量标记。选择合适的电压（３Ｖ／ｃｍ～５Ｖ／ｃｍ），电泳时间为５０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。８　结果判断８．１　样品犇犖犃抽提质量判断按照真核生物共有的核糖体１８ＳｒＤＮＡ基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的ＤＮＡ提取液进行ＰＣＲ扩增。均应扩增出１３７ｂｐ的片段，否则，说明提取的ＤＮＡ质量有问题，或者是ＤＮＡ溶液中存在ＰＣＲ反应的抑制因子，应该重新纯化或提取ＤＮＡ，直至扩增出该ＤＮＡ片段，防止检测中产生假阴性结果。８．２　外源基因的检测如果阴性对照与空白对照未扩增出ＤＮＡ片段，阳性对照扩出预期的ＤＮＡ片段，待测样品未扩增出预期的ＤＮＡ片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的ＤＮＡ片段，则可初步判定４犛犖／犜２０７４—２００８待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。８．３　结果确证实验与结果表述８．３．１　方法１　实时荧光犘犆犚检测方法待测样品外源基因ＰＣＲ扩增阳性结果的，按照ＳＮ／Ｔ１２０４中规定的方法执行。８．３．２　方法２　犘犆犚扩增产物的犇犖犃测序方法外源基因ＰＣＲ扩增阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与已知的该外源基因相应序列进行比对加以确证。注：可根据实验室条件任选一种方法进行确证。８．３．３　结果表述经８．３．１或８．３．２确证为阳性的，表述为：检出××××基因；确证为阴性的，表述为：未检出××××基因。９　样品保存９．１　保存条件干燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于－２０℃下。９．２　保存期限保存期限为３个月。５犛犖／犜２０７４—２００８