SNT 1310-2011 动物结核病检疫技术规范

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３１０—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３动物结核病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪狀犻犿犪犾狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３《猴结核皮内变态反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３相比，主要技术变化如下：———修改了标准的名称；———增加了细菌学检查方法；———增加了实时荧光ＰＣＲ方法；———增加了常规ＰＣＲ检测方法；———增加了其他动物结核皮内变态反应试验方法。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版）中２．４．７章“Ｂｏｖｉｎｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ”和２．３．６章“Ａｖｉａｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈茹、许如苏、田纯见、史夏玲、吴晓薇、曾碧健、苏世敏、罗长保、周科、鱼海琼、洪琼华、孙岩松。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３１０—２００３。Ⅰ犛犖／犜１３１０—２０１１动物结核病检疫技术规范１　范围本标准规定了动物结核病的结核菌素皮内变态反应试验、细菌学检查、实时荧光聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和常规ＰＣＲ检测方法的技术要求。本标准适用于进出境牛、猪、猴、禽等动物结核病的检疫和诊断。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＰＤ（ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）：提纯蛋白衍生物，提纯结核菌素ＩＵ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｕｎｉｔｓ）：国际单位ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ）：磷酸盐缓冲液ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷酸三磷酸犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶ＵＤＧ（ｕｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）：尿嘧啶ＤＮＡ糖基化酶ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）：二甲基亚砜ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）：碱基对４　生物安全要求样品采集、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守ＧＢ１９４８９的有关规定。５　结核菌素皮内变态反应试验５．１　器材５．１．１　弯剪。５．１．２　卡尺。５．１．３　注射器：可采用医用玻璃卡介苗注射器、皮试专用连续注射器或１ｍＬ一次性无菌注射器，针头规格为０．５ｍｍ×１０ｍｍ。５．１．４　脱脂棉。１犛犖／犜１３１０—２０１１５．２　试剂５．２．１　灭菌生理盐水。５．２．２　牛型ＰＰＤ：根据使用说明将原液用灭菌生理盐水或稀释用水稀释为使用浓度。ＰＰＤ冻干粉稀释：在无菌状态下吸取一定量的灭菌生理盐水或稀释用水，注入冻干粉玻璃瓶中，充分摇匀后使用，应现配现用。５．２．３　禽型ＰＰＤ：配制方法同５．２．２。５．２．４　人型ＰＰＤ：配制方法同５．２．２。５．２．５　７５％酒精。５．３　牛结核皮内变态反应试验５．３．１　操作方法与结果判定可单独采用牛型ＰＰＤ，也可同时采用牛型ＰＰＤ和禽型ＰＰＤ进行试验。注射部位在颈侧中部上三分之一处或尾根部。３个月以内的犊牛也可在肩胛部进行。应确认注入皮内。颈部术部剪毛，直径约１０ｃｍ，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录，术部应无病变。牛型和禽型ＰＰＤ的注射部位应间隔开，在颈部同侧应间隔约１２ｃｍ～１５ｃｍ，或在不同侧进行。用７５％酒精消毒注射部位，在皮内注入牛型ＰＰＤ或禽型ＰＰＤ，剂量为牛型ＰＰＤ每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量；禽型ＰＰＤ每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量。注射后７２ｈ观察判定结果。仔细观察局部有无发热、肿胀等炎性反应，用卡尺测量皮皱厚度，注射前后同一部位的卡尺测量方向应保持一致。在记录表上作好详细记录。５．３．２　单独采用牛型犘犘犇颈部注射。术部注射前后皮厚差大于或等于４ｍｍ，或出现典型炎性反应，判为阳性；皮厚差大于２ｍｍ并小于４ｍｍ，且无典型炎性反应判为可疑；皮厚差小于或等于２ｍｍ，无典型炎性反应，判为阴性。对于已确认感染的牛群，皮试出现任何可触摸或可见的肿胀反应均判为阳性。尾根部注射。出现反应判为阳性，未出现可触摸或可见的炎性反应判为阴性。５．３．３　同时采用牛型犘犘犇和禽型犘犘犇注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差大于注射禽型ＰＰＤ部位的皮厚差４ｍｍ以上，或对牛型ＰＰＤ反应为阳性（判定见５．３．２）、并且对牛型ＰＰＤ的反应大于对禽型ＰＰＤ的反应、两者皮厚差在２ｍｍ以上，判为牛型ＰＰＤ皮内变态反应试验阳性；其他情况下，注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差大于注射禽型ＰＰＤ部位的皮厚差１ｍｍ～４ｍｍ，判为牛型ＰＰＤ皮内变态反应试验可疑；注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差与注射禽型ＰＰＤ部位的皮厚差小于１ｍｍ，或注射牛型ＰＰＤ部位的皮厚差小于或等于注射禽型ＰＰＤ的部位，判为牛型ＰＰＤ皮内变态反应试验阴性；对禽型ＰＰＤ的反应大于对牛型ＰＰＤ的反应，二者皮厚差在２ｍｍ以上，判为禽型ＰＰＤ皮内变态反应试验阳性。５．３．４　复检判为可疑反应的，于４２ｄ后进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。５．４　猴结核皮内变态反应试验５．４．１　操作方法由助手对猴进行保定，使其两前肢向背后，用左手抓住猴头部后侧的皮毛，使之不得任意转动。注２犛犖／犜１３１０—２０１１射部位为上眼睑。用７５％酒精对上眼睑局部消毒，术者左手固定头部，右手持１ｍＬ注射器，针头斜面向上，与上眼睑平行，距睫毛约５ｍｍ，皮内注射０．１ｍＬ牛型ＰＰＤ或人型ＰＰＤ，剂量为牛型ＰＰＤ２０００ＩＵ～２５００ＩＵ，人型ＰＰＤ４０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量。注射后无异常反应，局部有扁豆粒大小的隆起。５．４．２　结果判定注射后４８ｈ、７２ｈ观察判定结果。仔细检查注射部位有无热、红、肿等炎性反应，并与对侧正常上眼睑进行对照。上眼睑发红，注射部位肿胀明显，判为阳性；上眼睑轻度发红，无肿胀，判为可疑；上眼睑无反应，判为阴性。５．４．３　复检判为可疑反应的，于３０ｄ后在另一侧进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。５．５　禽结核皮内变态反应试验５．５．１　操作方法家禽可在肉髯皮内注射禽型ＰＰＤ，剂量为每羽０．１ｍＬ，约２０００ＩＵ或按试剂说明书配制的剂量。５．５．２　结果判定注射后４８ｈ观察判定结果。注射部位肿胀，出现硬结、扩展至对侧肉髯和颈部的广泛性水肿等炎性反应，判为阳性；注射部位无肿胀等炎性反应，判为阴性。５．６　猪结核皮内变态反应试验５．６．１　操作方法采用牛型和禽型ＰＰＤ，耳根部皮内注射。牛型ＰＰＤ剂量为每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量；禽型ＰＰＤ剂量为每头０．１ｍＬ、不低于２０００ＩＵ，或按试剂说明书配制的剂量。５．６．２　结果判定注射后７２ｈ观察判定结果。注射部位出现明显肿胀等炎性反应，判为阳性；注射部位无反应判为阴性。５．７　其他动物结核病皮内变态反应试验羊、鹿等其他大中动物的皮内变态反应试验参照牛的皮内变态反应试验进行。６　细菌学检查６．１　设备Ⅱ级生物安全柜，恒温培养箱，冰箱（２℃～８℃，－１８℃），离心机（离心力可达２０００犵），显微镜。６．２　试剂除特别规定，所用化学试剂为分析纯。溶液与培养基：４％硫酸，３％或４％氢氧化钠溶液，５％～１０％盐酸溶液，氢氧化钠消化液，０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠溶液、安替福民（ａｎｔｉｆｏｒｍｉｎ）溶液、甘油蛋白、萋尼氏（ＺｉｅｈｌＮｅｅｌｓｅｎ）抗酸染色液，对硝基苯甲３犛犖／犜１３１０—２０１１酸（ＰＮＢ）培养基、ＰＢＳ（１／１５ｍｏｌ／Ｌ）缓冲液、改良罗氏（ＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎＪｅｎｓｅｎ，ＬＪ）培养基、吐温８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水解试验溶液、硝酸盐还原试验溶液、０．２％氨基苯磺胺、０．１％犖甲基盐酸二氨基乙烯、０．１２％尿素溶液、０．１％酚红指示剂、噻吩２羧酸肼（ＴＣＨ）培养基。配制方法见附录Ａ。６．３　病料的采集、运送与处理６．３．１　病料的采集对于病、死动物，应采集其淋巴结及病变组织器官（如：肝、脾、肺等）作为细菌学检查的材料；对于怀疑有呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核的活畜，应相应采集其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便作为细菌学检查的材料；对于皮内变态反应试验阳性，但尸检无病理学变化的动物，应采集其下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵膈及一些肠系膜的淋巴结作为细菌学检查的材料。６．３．２　病料的运送样品应封装在无菌的洁净容器或样品袋内冷藏运送。如当天无法送达实验室的，应予冷冻后运送。当无法提供冷冻条件时，可在病料中加入硼酸，使其终浓度为０．５％，但样品处理保存时间不超过１周。６．３．３　病料的前处理６．３．３．１　硫酸处理法此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。处理前，病变组织先按常规方法研磨或匀浆制成乳剂。用４％硫酸溶液将痰、尿、粪或病变组织等按１∶５之比例加入混合，然后置３７℃作用１ｈ～２ｈ，经１０００犵离心３０ｍｉｎ，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸处理后，在沉淀物中滴加３％氢氧化钠溶液中和，然后涂片镜检、培养。６．３．３．２　氢氧化钠处理法此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。消化处理前，病变组织先按常规方法制成乳剂。将被检的痰、尿、粪便或病变组织按１∶５的比例加入氢氧化钠消化液中，混匀后，３７℃作用２ｈ～３ｈ，然后无菌滴加５％～１０％盐酸溶液进行中和，将样本的ｐＨ调到６．８左右（此时显淡黄绿色），以１０００犵离心１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养。对痰液的消化浓缩还可采用以下处理方法：取４％氢氧化钠溶液５０ｍＬ，０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸钠５０ｍＬ，犖乙酰Ｌ半胱氨酸０．５ｇ混合。取痰液按１∶２的比例加入上述混合液，作用２４ｈ～４８ｈ，以１０００犵离心１５ｍｉｎ，取沉淀物涂片镜检、培养。６．３．３．３　安替福民（犪狀狋犻犳狅狉犿犻狀）溶液处理法此法适用于痰、乳、精液和子宫分泌液等的处理。将被检样品置于试管中，加入３倍～４倍量的１５％～２０％安替福民溶液，充分摇匀后３７℃作用１ｈ，加１倍～２倍量的灭菌蒸馏水，摇匀，１０００犵离心２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养。６．４　染色镜检６．４．１　涂片先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白，然后吸取处理好的样品滴加其上，涂布均匀。如被检样品为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，滴加二甲苯或乙醚，使其覆盖整个涂片，摇４犛犖／犜１３１０—２０１１动１ｍｉｎ～２ｍｉｎ脱脂后倾去，再滴加９５％酒精，以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。６．４．２　萋尼氏抗酸染色涂片经火焰固定后，滴加苯酚复红染色液，使其覆盖整个涂片。之后，将玻片置于火焰上加热至出现蒸汽但不产生气泡，脱离火焰，保持染色５ｍｉｎ。如热染过程出现染色液干涸，应及时添加，适量补充。充分水洗后滴加３％盐酸酒精脱色液，脱色３０ｓ～６０ｓ，至无色素脱下为止。充分水洗，以骆氏美蓝染色液复染１ｍｉｎ。水洗，吹干，镜检。６．４．３　镜检分枝杆菌为抗酸菌，因不被盐酸酒精脱色而染成红色，而其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。在显微镜下，分枝杆菌呈细长平直或微弯曲的杆菌，长１．５μｍ～５μｍ，宽０．２μｍ～０．５μｍ，在陈旧培养基或干酪性淋巴结内，偶尔可见长达１０μｍ或更长的菌体。６．５　分离培