SNT 0169-2010 进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$%!!代替!#$%&!$&&’!#(((!$&&)和!#*$#+&,’!’##’进出口食品中大肠菌群$粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法$%&%’()*+&),*,-.,/)-,’(-%.+/.,/)-,’(+*0!#$%&’#$’(#)*’)*-,,0-,’)(1,’&+*0%21,’&%!!33!发布%!3!&3!实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ０１６９—１９９２《出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》、ＳＮ０３３３—１９９４《出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法》和ＳＮ／Ｔ１０５９．２—２００２《进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜／ＭＵＧ法》。本标准与ＳＮ０１６９—１９９２、ＳＮ０３３３—１９９４和ＳＮ／Ｔ１０５９．２—２００２相比，主要技术变化如下：———将原标准名称《出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》、《出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法》和《进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜／ＭＵＧ法》整合修订为《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》；———ＳＮ０１６９—１９９２标准的范围不变，但ＳＮ０３３３—１９９４和ＳＮ／Ｔ１０５９．２—２００２标准的范围有限，因此，本标准将范围进行整合修订；———增加了规范性引用文件；———增加了术语和定义；———在设备和材料中删掉了乳钵和研棒，稀释瓶中增加了“其他适宜的容器”；———对液体样品ＭＰＮ法的检测修订为：液体样品接种量１ｍＬ以上者，用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；接种量１ｍＬ及１ｍＬ以下者，则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；———平板计数法中删去了计算公式；———ＭＰＮ值表增加了“９５％置信区间”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：付宝莲、刘中学、侯丽萍、高飞。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ０１６９—１９９２；———ＳＮ０３３３—１９９４；———ＳＮ／Ｔ１０５９．２—２００２。Ⅰ犛犖／犜０１６９—２０１０进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法１　范围本标准规定了进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法。本标准中ＭＰＮ法适用于进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验；平板计数法适用于进出口食品中大肠菌群的检验；β葡萄糖苷酶荧光法适用于进出口食品（不包括贝类）中大肠杆菌的检验；滤膜／ＭＵＧ法适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、饮料、牛奶（需用蛋白酶处理）、单晶糖和椒粒中大肠菌群和大肠杆菌的检验。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１５３８．１　培养基制备指南　第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１５３８．２　培养基制备指南　第２部分：培养基性能测试实用指南３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１大肠菌群　犮狅犾犻犳狅狉犿需氧及兼性厌氧，能在３７℃４８ｈ分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。３．２粪大肠菌群　犳犲犮犪犾犮狅犾犻犳狅狉犿需氧及兼性厌氧，能在４４．５℃±０．５℃，２４ｈ发酵乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌又可称耐热大肠菌群（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔｃｏｌｉｆｏｒｍｏｒｇａｎｉｓｍｓ）。３．３大肠杆菌　犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻需氧及兼性厌氧，能在４４．５℃±０．５℃４８ｈ分解乳糖产酸产气，生化特征“ＩＭＶｉＣ”为“＋＋－－或－＋－－”的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌又可称大肠埃希氏菌。４　检验方法４．１　原理４．１．１　最可能近似值（犿狅狊狋狆狉狅犫犪犫犾犲狀狌犿犫犲狉，犕犘犖）法ＭＰＮ法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出大肠菌群、粪大肠菌群或大肠杆菌在１犛犖／犜０１６９—２０１０待测样品中的最大可能数。４．１．２　平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。４．１．３　β葡萄糖苷酶荧光法大肠杆菌中的β葡萄糖苷酶可降解培养基中４甲基伞形酮βＤ葡萄糖苷酸（ＭＵＧ），并释放４甲基伞形酮荧光物质（４ＭＵ），该物质在紫外灯（波长３６６ｎｍ）下会显现蓝色荧光特点。４．１．４　滤膜／犕犝犌法待测样品通过滤膜过滤时，样品中的大肠菌群和大肠杆菌被截留于滤膜表面。将滤膜贴附于ＬＭＧ或ＢＭＡ琼脂上培养后，大肠菌群在ＬＭＧ琼脂上会形成蓝色菌落；而ＢＭＡ琼脂上的大肠杆菌由于葡萄糖苷降解４甲基伞形酮βＤ葡萄糖苷酸（ＭＵＧ）并释放４甲基伞形酮，形成紫外光（３６６ｎｍ）下为蓝白色荧光的菌落。４．２　培养基与试剂４．２．１　生理盐水：见附录Ａ．１。４．２．２　Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ氏磷酸盐缓冲稀释液：见附录Ａ．２。４．２．３　月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（ＬＳＴ）：见附录Ａ．３。４．２．４　煌绿乳糖胆盐肉汤（ＢＧＬＢ）：见附录Ａ．４。４．２．５　大肠杆菌肉汤（ＥＣ）：见附录第Ａ．５。４．２．６　伊红美蓝琼脂（ＥＭＢ）：见附录Ａ．６。４．２．７　结晶紫中性红胆盐琼脂（ＶＲＢＡ）：见附录Ａ．７。４．２．８　月桂基硫酸盐胰蛋白胨ＭＵＧ肉汤（ＬＳＴＭＵＧ）：见附录Ａ．８。４．２．９　ＣｏｌｕｍｂｉａＭＵＧ：见附录Ａ．９。４．２．１０　蛋白胨吐温８０稀释液（ＰＴ）：见附录Ａ．１０。４．２．１１　乳糖莫能菌素葡萄糖酸琼脂（ＬＭＧ）：见附录Ａ．１１。４．２．１２　缓冲ＭＵＧ琼脂（ＢＭＡ）：见附录Ａ．１２。４．２．１３　三（羟甲基）胺甲烷（Ｔｒｉｓ）缓冲剂：见附录Ａ．１３。４．２．１４　营养琼脂斜面：见附录Ａ．１４。４．２．１５　色氨酸肉汤：见附录Ａ．１５。４．２．１６　ＭＲＶＰ培养基：见附录Ａ．１６。４．２．１７　Ｋｏｒｓｅｒ氏枸椽酸盐肉汤：见附录Ａ．１７。４．２．１８　Ｋｏｖａｃｓ氏靛基质试剂：见附录Ａ．１８。４．２．１９　甲基红指示剂：见附录Ａ．１９。４．２．２０　ＶＰ试剂（ＶＰ）：见附录Ａ．２０。４．２．２１　革兰氏染色液：见附录Ａ．２１。４．２．２２　胰蛋白酶贮存液：见附录Ａ．２２。４．３　设备与材料４．３．１　培养箱：３６℃±１℃，４４．５℃±０．５℃。４．３．２　水浴箱：３６℃±１℃，４４．５℃±０．５℃。２犛犖／犜０１６９—２０１０４．３．３　冰箱：０℃～５℃和－１５℃～－２０℃。４．３．４　均质器：涡旋式或拍击式。４．３．５　吸管：１ｍＬ，具０．１ｍＬ刻度；５ｍＬ和１０ｍＬ，具１ｍＬ刻度。４．３．６　平皿：直径９０ｍｍ。４．３．７　试管：１６ｍｍ×１６０ｍｍ。４．３．８　稀释瓶：三角烧瓶、广口瓶或其他适宜的容器。４．３．９　玻璃小倒管：长度约２０ｍｍ。４．３．１０　天平：感量０．１ｇ。４．３．１１　显微镜。４．３．１２　菌落计数器。４．３．１３　滤器：备预滤器。４．３．１４　滤膜：有机或水相，孔径０．４５μｍ。４．３．１５　真空泵。４．３．１６　紫外灯：波长３６６ｎｍ。４．４　样品制备４．４．１　固体或半固体样品无菌操作称取样品２５ｇ置于装有２２５ｍＬ灭菌稀释剂（４．２．１／４．２．２）的适宜容器中，充分振摇、混匀。或将剪碎后的试样２５ｇ置于灭菌的均质杯／袋内，加入２２５ｍＬ灭菌稀释剂，以８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ涡旋式均质１ｍｉｎ，或以６次／ｓ～９次／ｓ拍击式均质１ｍｉｎ，制成１∶１０的样品稀释液备用。４．４．２　液体样品以无菌吸管吸取样品２５ｍＬ置于装有２２５ｍＬ灭菌稀释剂的适宜容器中，以３０ｃｍ幅度于７ｓ内振摇２５次或机械振荡器中振摇。制成１∶１０的样品稀释液备用。４．４．３　样品稀释样品稀释液的ｐＨ值应在６．５～７．５之间，ｐＨ值过低或过高时可分别用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠或１ｍｏｌ／Ｌ盐酸予以调节。根据对样品污染情况的估计，将４．４．１或４．４．２制成的１∶１０样品稀释液用９ｍＬ灭菌稀释剂进行系列十倍递增稀释，如１０－２，１０－３，１０－４……，直至最高稀释度的检测结果达到阴性终点。每一稀释度换用１支１ｍＬ无菌吸管或移液器吸头，上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的稀释液。从制备样品稀释液至稀释完毕，全过程不得超过１５ｍｉｎ。４．４．４　样品的酶处理４．４．４．１　一般要求样品的酶处理可在室温下（２３℃～２７℃）进行。４．４．４．２　固体或半固体样品无菌操作称取样品２５ｇ置于装有２２５ｍＬ灭菌ＰＴ稀释液（４．２．１０）的适宜容器中，充分振摇、混匀。或将剪碎后的试样２５ｇ置于灭菌的均质杯／袋内，加入２２５ｍＬ灭菌稀释剂，以８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ涡旋式均质１ｍｉｎ，或以６次／ｓ～９次／ｓ拍击式均质１ｍｉｎ，制成１∶１０的样品稀释液备用。３犛犖／犜０１６９—２０１０４．４．４．３　液体样品以无菌吸管吸取样品２５ｍＬ置于装有２２５ｍＬ灭菌ＰＴ稀释液的适宜容器中，以３０ｃｍ幅度于７ｓ内振摇２５次或机械振荡器中振摇。制成１∶１０的样品稀释液备用。４．４．４．４　样品稀释取１∶１０的酶ＰＴ稀释液（胰蛋白酶贮存液：ＰＴ稀释液）１０ｍＬ于４．４．４．１或４．４．４．２制成的１∶１０样品稀释液中并混匀，置于３６℃±１℃水浴中处理２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ后，将制成的１∶１０样品酶处理稀释液用９ｍＬ灭菌ＰＴ稀释液进行系列十倍递增稀释，如１０－２，１０－３，１０－４……，直至最高稀释度的检测结果达到阴性终点。每一稀释度换用１支１ｍＬ无菌吸管或移液器吸头，上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的稀释液。从制备样品稀释液至稀释完毕，全过程不得超过４５ｍｉｎ。４．４．４．５　样品过滤将灭菌过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上并固定。无菌操作加入１０ｍＬ～２０ｍＬ无菌蒸馏水于滤器中，打开真空泵，抽吸过滤，再从４．４．４．４中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度分别过滤，每次１０ｍＬ。最后再加入１０ｍＬ～１５ｍＬ无菌蒸馏水，抽吸过滤后，关闭真空泵，用无菌镊子将滤膜取出于４．５．３中备用。４．５　大肠菌群的测定４．５．１　犕犘犖法４．５．１．１　从４．４．３中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ＬＳＴ）肉汤，每管接种１ｍＬ。液体样品接种量１ｍＬ以上者，用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；接种量１ｍＬ及１ｍＬ以下者，则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。３６℃±１℃培养２４ｈ～４８ｈ后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录２４ｈ和４８ｈ内产气的ＬＳＴ肉汤管数。对未产气管有疑问时，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如所有ＬＳＴ肉汤管均未产气，可按４．８．１报告结果；如ＬＳＴ肉汤管有产气，则按４．５．１．２作证实试验。４．５．１．２　证实试验。用直径３ｍｍ的接种环从４．５．１．１中所有２４ｈ和４８ｈ内发酵产气的ＬＳＴ肉汤管中分别挑取培养液１环，分别移种于煌绿乳糖胆盐（ＢＧＬＢ）肉汤管中，于３６℃±１℃培养４８ｈ±２ｈ，记录所有ＢＧＬＢ肉汤管的产气管数，根据ＢＧＬＢ肉汤的产气管数查ＭＰＮ表（见附录Ｂ．１）并按４．８．１报告结果。４．５．２　平板计数法４．５．２．１　从４．４．３中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿１ｍＬ。另取１ｍＬ稀释剂加入一灭菌平皿中，作空白对照。将冷至４６℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（ＶＲＢＡ）约１５ｍＬ倾注于每个平皿中，小心旋转平皿，使培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后，再加３ｍＬ～４ｍＬ的ＶＲＢＡ均匀覆盖于平板表层，凝固后翻转平皿，３６℃±１℃培养１