DB33∕T 2183-2019 家蚕核型多角体病抗性鉴定方法

ICS65.020.30B40DB33浙江省地方标准DB33/T2183—2019家蚕核型多角体病抗性鉴定方法Regulationofidentificationforsilkwormnuclearpolyhedrosisresistance2019-01-15发布2019-02-15实施浙江省市场监督管理局发布DB33/T2183-2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：浙江大学蚕蜂研究所、浙江大学农业技术推广中心、浙江省农业技术推广中心、浙江省蚕种质量检验检疫站、浙江省农业科学院蚕桑研究所、桐乡市蚕业有限公司、浙江省种植业管理局。本部分主要起草人：鲁兴萌、周金钱、邵勇奇、楼霞、赵新华、谷利群、王永强、徐杰、张三妹、黄衍峰。DB33/T2183-20191家蚕核型多角体病抗性鉴定方法1范围本标准规定了家蚕核型多角体病抗性鉴定的术语和定义，家蚕核型病毒多角体试验用悬浮液的制备、计数及保存，半数致死浓度测定，抗性鉴定评价。本标准适用于家蚕一代杂交种的核型多角体病抗性评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定DB33/T2019蚕种生产技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1家蚕核型多角体病病毒bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus为杆状病毒科、真杆状病毒亚科、核型多角体病毒属的一种。3.2家蚕核型多角体病病毒多角体bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirusandinclusionbody家蚕核型多角体病病毒在家蚕体内繁殖后，形成包埋了大量病毒的多角体，在生物光学显微镜下呈六角形，并具有较强折光性。3.3家蚕核型多角体病silkwormnuclearpolyhedrosis核型多角体病病毒在家蚕体内大量繁殖，蚕体呈乳白色、体躯肿胀、狂躁爬行、体壁易破典型病征，或致死的病害。DB33/T2183-201923.4半数致死浓度medianlethalconcentration（LC50）在规定时间内，通过添食攻毒感染，使2龄家蚕半数死亡所需的病毒多角体浓度。3.5攻毒challengetest以人工添毒的方法，将病毒多角体悬浮液均匀涂抹于桑叶背面，喂饲家蚕使之感染。3.6抗性指数resistanceindex用于衡量参试蚕品种抗性的指数，以参照品种LC50平均值为100R。4家蚕饲养按DB33/T2019中简化催青的要求催青，常规饲养至2龄起蚕。5家蚕核型病毒多角体试验用悬浮液的制备、计数及保存5.1悬浮液的制备5.1.1添食将纯化的病毒多角体，用蒸馏水配成1×106个/毫升浓度的攻毒液。取3片大小约10cm×10cm清洁桑叶，用脱脂小棉球蘸取5ml，均匀涂抹在每片桑叶背面，喂饲100头4龄起蚕，基本食净后(约12h)，改用清洁桑叶喂饲。在24℃～25℃的温度下，饲养7d～10d备用。5.1.2制备从饲养的攻毒蚕中，选择有体色乳白和体躯肿胀典型病征，但尚未出现狂躁爬行病症和皮破之前，用剪刀从病蚕的腹足或尾角收集其体液，经2层脱脂纱布过滤，然后将滤液用3000r/min离心10min，弃上清；沉淀用无菌生理盐水充分悬浮后，再用3000r/min离心10min，弃上清；重复离心3次～5次，至沉淀呈较为均质的乳白色，再用少量无菌生理盐水充分悬浮，即成病毒多角体悬浮液。5.2病毒多角体的计数用血球计数板计数病毒多角体悬浮液中多角体的数量，并用无菌生理盐水调成1×109个/毫升的病毒多角体悬浮液母液，直接使用或置4℃冰箱内备用。5.3病毒多角体悬浮液的保存5.3.1保存方法DB33/T2183-20193将病毒多角体悬浮液置4℃保存。5.3.2保存时间病毒多角体悬浮的有效保存时间为≤2年。6半数致死浓度测定6.1攻毒用多角体悬浮液的配制将病毒多角体悬浮液母液（1×109个/毫升）用无菌生理盐水稀释成1×109个/毫升、1×108个/毫升、1×107个/毫升、1×106个/毫升和1×105个/毫升的稀释病毒多角体悬浮液。也可采用类似的其它10倍梯度方法制作稀释病毒多角体悬浮液。病毒多角体悬浮液母液及梯度稀释液的有效保存时间为≤1个月。6.2攻毒对象和设区6.2.1攻毒对象测试蚕品种、对照蚕品种的2龄起蚕。6.2.2攻毒设区设5个10倍稀释浓度病毒多角体悬浮液，每个浓度设3个重复区，每个重复区30头蚕。同时设无菌生理盐水添食作对照区。6.3攻毒添食与饲养取1片清洁适龄桑叶，切成约5cm×5cm的方块叶，用小脱脂棉球将200μL的病毒多角体悬浮液均匀涂抹在方块叶背面后喂食。待桑叶基本食净（约12h）后，改饲清洁桑叶，在25℃～27℃的温度下饲养。6.4病死蚕计数6.4.1校验对照区有非核型病毒多角体病因素引起的异常，试验重做。6.4.2病死蚕统计从2龄起蚕攻毒开始到2眠眠起止，为病死蚕计数时间。有核型病毒多角体病典型病征的蚕，计为病死蚕；没有典型病征的3龄起蚕，计为健康蚕。对不能确定的迟眠蚕，取其血用显微镜检查，检到有家蚕核型病毒多角体的，计入病死蚕。计算各浓度区的死亡率和平均死亡率。6.5半数致死浓度的计算半数致死浓度（LC50）的计算，采用Reed-Muench法。………………..(1)式中：DB33/T2183-20194LC50——半数致死浓度；DU50——死亡率超过50%试验组的累计死亡率；DD50——死亡率低于50%试验组的累计死亡率；logN——稀释因子的对数；DU50-log——累计死亡率超过50%试验组的病毒多角体悬浮液浓度对数。7抗性鉴定评价7.1抗性参照蚕品种抗性参照蚕品种设2个，菁松×皓月(正反交)、秋丰×白玉(正反交)。参照品种与待鉴定评价品种同步试验，按照本标准第6章计算LC50。7.2抗性指数以2个参照蚕品种的LC50平均值为100R，再根据待测蚕品种的LC50换算出该品种的抗性指数。7.2.1参照蚕品种的半数致死浓度平均值RLCCKLCCKLCCKLCCKCKLC100450450350250150...............(2)式中：CKLC50——参照品种的半数致死浓度平均值；CK1LC50、CK2LC50、CK3LC50、CK4LC50——2个对照品种（正反交）的半数致死浓度；100R——对照种抗性指数。7.2.2待测蚕品种的抗性指数RCKLCTGLCTGI1005050.................................(3)式中：TGI——待测蚕品种的抗性指数；TGLC50——待测蚕品种的半数致死浓度；CKLC50——对照品种的半数致死浓度平均值。7.3抗性等级评级按照表1对家蚕品种的核型多角体病毒抗性等级作出鉴定评价。表1家蚕对核型多角体病毒的抗性等级核型多角体病抗性等级抗性指数应用建议超强(Ultrastrong)1600R可在家蚕核型多角体病流行严重的蚕区饲养强(Strong)201R～1600R可在家蚕核型多角体病流行较严重的蚕区饲养一般(General)50R～200R可在非家蚕核型多角体病流行的蚕区饲养弱(Weak)＜50R慎用DB33/T2183-201958数据修约按GB/T8170要求，保留2位小数。_________________________________