DB61∕T 1158.4-2018 桑黄标准综合体 第4部分液体菌种生产技术规程

ICS65.020.01B39DB61陕西省地方标准DB61/T1158.4—2018桑黄标准综合体第4部分：液体菌种生产技术规程IntegratedStandardsofPhellinusspp.—Part4：TechnicalRulesforLiquidInoculumPreparation2018-05-01发布2018-06-01实施陕西省质量技术监督局发布DB61/T1158.4—2018I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13栽培场地..........................................................................14栽培环境..........................................................................15栽培设施..........................................................................2附录A（规范性附录）食用菌生产场所处理方法..........................................3DB61/T1158.4—2018II前言DB61/T1158—2018《桑黄标准综合体》分为六个部分：——第1部分：生产环境；——第2部分：菌种；——第3部分：菌种生产技术规程；——第4部分：液体菌种生产技术规程；——第5部分：桑黄栽培技术规程；——第6部分：子实体干品质量要求。本部分为DB61/T1158—2018的第4部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由陕西省农业厅提出并归口。本部分起草单位：陕西省微生物研究所、杨凌康宇生物科技有限公司、陕西省园艺蚕桑工作站。本部分主要起草人：雷萍、吴亚召、张文隽、渠敬峰、王周平、张伟兵、霍国琴、赵玉鹏、马莹、杜艳。本部分由陕西省微生物研究所负责解释。本部分首次发布。联系信息如下：单位：陕西省微生物研究所地址：西安市雁塔区西影路76号邮编：710043电话：[phone]DB61/T1158.4—20181桑黄标准综合体第4部分：液体菌种生产技术规程1范围DB61/T1158的本部分规定了桑黄液体菌种的生产条件、生产工艺及标签、贮存。本部分适用于袋料栽培的桑黄液体菌种生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB5749生活饮用水卫生标准NY/T528食用菌菌种生产技术规程NY5099无公害食品食用菌栽培基质安全技术要求DB61/T1158.3桑黄标准综合体第3部分：菌种生产技术规程《食用菌菌种管理办法》中华人民共和国农业部第62号令（2006年3月27日）3生产条件3.1技术人员按照《食用菌菌种管理办法》的规定配备菌种生产的专业技术人员。3.2生产场地3.2.1地势干燥、空气优良、通风良好、水源充足且符合GB5749生活饮用水卫生标准、排水畅通、交通便利，电源充足，有硬质路面排水良好的道路。3.2.2环境卫生应符合NY/T528的规定。300m之内无禽畜舍，无垃圾场，无污水、粉尘污染源。3.3生产厂房3.3.1液体菌种生产车间3.3.1.1地面应防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，应有1.0%～1.5%的排水坡度和良好的排水系统。3.3.1.2墙壁和天花板应具有防潮、防霉、防水功能，且易清洗；电力满足生产要求，通风良好。3.3.2液体菌种接种间3.3.2.1应设置缓冲间及与接种人数相适应的更衣室。3.3.2.2车间入口处设置洗手、消毒和干手设备。放置封闭式废物桶，安装排风设备，门窗应安装防蚊蝇纱网。DB61/T1158.4—201823.3.3发酵室内壁和房顶光滑易清洗和消毒。3.4设施设备按照DB61/T1158.3中3.3要求配备。3.5培养基质应符合NY5099无公害食品食用菌栽培基质安全技术要求的规定。4生产工艺4.1工艺流程母种→摇瓶种制备→种子罐菌种制备→液体菌种发酵→菌种检测。4.2摇瓶种制备4.2.1培养基按照附录A规定配制。4.2.2装液量采用500mL的常规三角瓶，每瓶装量为100mL～150mL，八层纱布和牛皮纸封口。4.2.3灭菌在121℃～126℃，0.14MPa～0.17MPa的压力下，保持30分钟。4.2.4接种将灭菌后的培养基冷却至30℃以下，无菌条件下每瓶接入0.3cm2～0.5cm2母种1块。4.2.5培养（27±1）℃静止培养24h后，移至摇床130r/min～150r/min振荡频率下培养48h，再调至150r/min～180r/min，继续培养72h～96h。4.2.6移种标准4.2.6.1菌体形态：桑黄菌丝长分支，发酵液清香，颜色清亮、浅褐色，菌丝球多，菌液稍有黏稠。4.2.6.2菌丝量：10%～15%（湿重）。4.2.6.3酸碱度：发酵液pH5.0～5.5。4.2.6.4镜检：平皿检验无杂菌。4.3种子罐菌种制备4.3.1培养基按照附录A规定配制。DB61/T1158.4—201834.3.2装液量发酵罐体积的60%。4.3.3灭菌用夹层预热培养基至80℃后，蒸汽进罐升温至121℃～124℃，0.11MPa～0.14MPa保压恒温40min。4.3.4接种在无菌条件下接种，接种量为10%～15%；接种后调节进、排气阀，使罐压保持在0.02MPa～0.04MPa之间。4.3.5培养搅拌转速120r/min～150r/min，温度（27±1）℃培养120h。定时用肉汤培养基（按照附录C规定配制）检查发酵液的无菌情况，显微镜检查菌体的状况。每隔8h或12h取样液进行一次无菌检验。用2支肉汤试管及1只培养皿（培养基按照附录D规定配制）同时检验。肉汤连续3次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混浊，平板培养连续3次有杂菌菌落出现为染菌。肉汤阳性反应不明显，发酵液各项参数表明确有可疑的染菌反应，经镜检证实有杂菌存在，也应判断为染菌。4.4液体菌种发酵4.4.1液体培养基制作4.4.1.1按照附录B规定配制。水质应符合GB5749的规定。4.4.1.2灭菌按照发酵罐厂家型号使用说明书的要求进行操作。4.4.2菌种接入罐体在无菌条件下接种，接种量为10%～15%。4.4.3液体菌种培养罐温：（28±2）℃。罐压：（0.3～0.4）×105Pa。通气量：1︰0.5V/V·min。搅拌速度：150r/min～180r/min。培养时间：96h～120h。4.5液体菌种检测接种后第4d进行检测，按照无菌操作取样，将样液接于GB4789.28规定的试管斜面或培养皿的培养基上，（28±2）℃培养2d～5d，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况。若无细菌、霉菌等杂菌菌落生长，则表明该样品无杂菌污染。5液体菌种合格指标5.1感官指标DB61/T1158.4—201845.1.1菌丝形态与色泽：具有“毛刺”的球状菌丝体呈米白色，菌液呈棕色。5.1.2菌液形态：菌液稍粘稠，有大量菌丝体悬浮、分布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球间液体不浑浊。5.1.3菌液气味：有桑黄菌液体培养时特有的香气，无酸、臭味等，培养器排气口气味正常。5.2理化指标5.2.1酸碱度：pH值5.5～6.0。5.2.2菌丝量：菌丝湿重（g/L）≥80。5.2.3菌丝形态和杂菌鉴别：显微镜下可见桑黄菌种液体培养中特有的菌丝形态，初始阶段菌丝壁薄，黄绿色透明，顶端钝圆，有一主干，极少分支，具不明显的简单分隔，原生质丰富，直径0.3µm～1µm。老熟菌丝隔膜处常隆起，骨棒状，菌丝分支处偶有直角分支。深层发酵培养菌丝体大量分布，菌丝缠绕结成球状，表面有凸起的菌刺，菌刺形状分支较多。菌丝无锁状联合。无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。6标签、贮存6.1标签生产的菌种必须贴有菌种质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期。6.2贮存6.2.1摇瓶种保存4℃、暗光条件下可保存5d～7d。6.2.2种子罐液体菌种保存15℃～20℃可保存1d～2d。DB61/T1158.4—20185AA附录A（规范性附录）常用摇瓶种培养基A.1常用摇瓶种培养基A.1.1葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，pH值6.0。玉米粉，豆饼粉均过80目筛。A.1.2可溶性淀粉3%～6%，白砂糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，pH值6.0。DB61/T1158.4—20186BB附录B（规范性附录）常用发酵罐培养基B.1常用发酵罐培养基B.1.1葡萄糖3%，豆饼粉2%，玉米粉1%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸镁0.05%，pH值6.0。玉米粉，豆饼粉均过80目筛。B.1.2可溶性淀粉3%～6%，白砂糖1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，酵母膏0.1%，pH值6。B.1.3玉米粉1%、麸皮1%、葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.5%、KH2PO4溶液0.1%、MgSO4溶液0.05%、维生素B110mg/100mL、pH自然。玉米粉，麸皮粉碎均过80目筛。DB61/T1158.4—20187CC附录C（规范性附录）肉汤培养基C.1肉汤培养基C.1.1牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，酚红溶液2mL，葡萄糖3g，水1000mL，pH7.3～7.6（灭菌前）。C.1.2酚红溶液：取酚红1g，用10mL95％乙醇溶解，加90mL蒸馏水。DB61/T1158.4—20188DD附录D（规范性附录）平板杂菌检验培养基D.1平板杂菌检验培养基牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，琼脂20g，葡萄糖3g，水1000mL。_________________________________