DB36∕T 1036-2018 芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程

ICS65.020.20B15DB36江西省地方标准DB36/T1036-2018芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程TechniquelyRulesforDiagnosisandDetectionofSesameBacterialWilt[RalstoniasolanacearumSmith]2018-07-03发布2019-01-04实施江西省质量技术监督局发布DB36/T1036-2018I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12术语和定义........................................................................13症状诊断..........................................................................14病原菌形态学鉴定与致病性测定......................................................15病原菌PCR检测....................................................................2附录A（资料性附录）培养基配制方法..................................................3附录B（资料性附录）PCR检测引物、反应体系条件......................................4DB36/T1036-2018II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由江西省农业厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院。本标准主要起草人：华菊玲、李信申、黄小梅、刘清兰、熊艳、黄瑞荣、王希、史建苗、盛琦、饶喜。DB36/T1036-20181芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程1范围本标准规定了芝麻细菌性青枯病（Sesamebacterialwilt）诊断及检测技术的术语和定义、症状诊断、病原菌形态学鉴定与致病性测定和病原菌PCR检测。本标准适用于芝麻细菌性青枯病症状诊断、病原菌形态学鉴定及PCR检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.116srRNA序列细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。具有高度的保守性和特异性。16srRNA基因检测技术已成为病原细菌检测和鉴定的重要方法。2.2ITS序列16S～23SrRNA基因区间的一段高度可变序列，该区域种间多态性丰富，而种内却非常保守，这些特点使得它在细菌分类鉴定研究上具有独特的优势。3症状诊断初期在茎杆上出现暗绿色水浸状斑块，继而呈黑褐色条斑向上下扩展，顶梢常有2个～3个梭形溃疡状裂缝，部分病茎溃疡状裂缝可延伸至茎杆中下部，溃疡状裂缝出现早而多的病株常呈畸形。病株顶端先出现萎蔫，继而整株呈失水状，早期夜间可恢复正常，后期则呈黑褐色枯死。病株茎部维管束变褐色，髓部空洞。折断茎杆常可见菌脓形成的透明细丝。茎杆表皮下常可见泡状隆起，刺破后有乳白色菌脓溢出，渐成为漆黑色晶亮的颗粒。4病原菌形态学鉴定与致病性测定4.1菌株分离与形态学鉴定4.1.1菌株分离采集典型的芝麻细菌性青枯病标本，剪取病健交界处病茎3cm～4cm，经75%酒精消毒、灭菌水冲洗后，剪去两头取中间段置于装有5ml～10ml无菌水的试管中静置5min左右至悬浮液变混浊，用接种环蘸DB36/T1036-20182取少量粗悬液分别在NA平板和TZC平板上划线或涂布。28℃培养72h后观察菌落形态。挑取典型菌落，进行光学显微镜下菌体的革兰氏染色、鞭毛染色和形态观察。4.1.2形态学鉴定根据以下形态学特征作为鉴定依据。青枯菌革兰氏染色反应为阴性，菌体杆状，具1根～4根极鞭，无荚膜。在NA培养基平板上于28℃培养72h，见附录A，菌落呈污白色，平滑有光泽，呈粘液状，直径2mm～3mm。在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（简称TZC，下同）选择性培养基上，28℃培养72h，产生的菌落呈不规则圆形，具流动性，中心呈红色至桔红色，边缘为白色，菌落直径2mm～5mm。4.2菌株致病性测定4.2.1接种体制备将形态学鉴定为青枯菌(R.solanacerum)的菌株于NA平板上培养活化48h后，配成1×108CFU/ml菌悬液供接种备用。4.2.2接种期芝麻初花期进行接种。用制备的菌悬液，回接芝麻健株，并以无菌水作为对照。4.2.3接种方法在26℃～30℃温室保湿条件下，采用以下3种方法接种：——剪叶接种：选择完全展开的叶片，用灭菌剪刀蘸取菌液剪叶；——针刺接种：用灭菌的小号注射器抽取菌液，在茎杆中部叶腋处针刺注射菌液，每株注射菌液0.1ml；——伤根灌菌液接种:用小铁铲从距茎基2cm～3cm处斜插入土，随后每株灌入菌液30ml。4.2.4结果调查接种10d～14d后，观察接种植株是否产生典型症状。选取典型症状的植株，再次进行病菌分离和形态学对比观察。从中选取典型菌株进行PCR检测。5病原菌PCR检测5.1特异性引物合成16SrRNA引物序列、16S～23SrRNA基因区间ITS引物序列见附录B。5.2PCR扩增以青枯菌标准菌株GMI1000为阳性对照，以灭菌双纯水为阴性对照。取无菌条件下培养的待检测菌株菌液少许为模板进行扩增。5.3琼脂糖凝胶电泳取扩增样品5µl，加入1µl6倍上样缓冲液（6×loadingbuffer），混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝胶（含0.05µl/mlEB或Goldview）上样孔中，用0.5×TBE缓冲液在5V/cm～8V/cm电压条件下电泳30min。5.4菌株16SrRNA、ITS序列测定与分析DB36/T1036-20183对5.3获得的阳性克隆进行序列测定。将测定得到的各菌株16SrRNA序列、ITS序列与GenBank中核酸数据进行BLAST对比分析，判定各待测菌株与标准模式菌株的同源性。DB36/T1036-20184AA附录A（资料性附录）培养基配制方法A.1NA培养基牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖或蔗糖10g，琼脂18g～20g，蒸馏水1000ml，pH7.4～7.6。高压湿热121℃灭菌25min。A.2TZC培养基配制——1%TZC溶液配制：称取1gTZC，用蒸馏水溶解并定容至100ml，用过滤法灭菌，避光保存备用。——TZC培养基制作：分别称取蛋白胨2g，水解酪蛋白0.2g，葡萄糖2g，琼脂粉4g。依次加入200ml蒸馏水中。加热溶化后，装入250ml三角瓶中，每瓶装200ml。121℃高压湿热灭菌25min后，培养基冷却至45℃左右时，于无菌条件下加入已灭菌的1%TZC溶液0.5ml，摇匀后倒入灭菌的培养皿中。DB36/T1036-20185BB附录B（资料性附录）PCR检测引物、反应体系条件B.1PCR引物B.1.116S引物序列分别为5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增片段大小为1523bp。B.1.2ITS引物序列为5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′；5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。扩增片段大小为591bp。B.2PCR反应体系25µLPCR反应体系：试剂名称用量10×PCR反应缓冲液（Buffer）2.5μLMgCl2(25mmol·L-1)2.0μLdNTP(2.5mmol·L-1)2μL引物-F(20μmol·L-1)0.5μL引物-R(20μmol·L-1)0.5μLTaqDNA聚合酶(5U·μL-1)0.25μL模板（template）0.5μLddH2O16.75μLtotal25μLB.3PCR反应条件DB36/T1036-20186反应条件为：95℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，35个循环；72℃7min。采用胶回收法回收。B.4序列测定PCR产物进行制备型琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带。选取阳性克隆进行序列测定。_________________________________