DB22T 2611-2017 梅花鹿冷冻精液

ICS65.020.30B44备案号：54486-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2611—2017梅花鹿冷冻精液Sikadeerfrozensemen2017-05-08发布2017-06-08实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：杨镒峰、魏海军、许保增、赵伟刚、赵蒙、陈秀敏、鞠妍、曹新燕、薛海龙、刁云飞、李晓霞、王世勇。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—20171梅花鹿冷冻精液1范围本标准规定了梅花鹿冷冻精液的规格、标识、解冻后精子活力、前进运动精子数、畸形率、菌落数、包装、储存运输。本标准适用于梅花鹿冷冻精液的生产、销售和使用过程中精液的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。GB/T2828.11计数抽样检验程序第11部分：小总体声称质量水平的评定程序GB/T5458液氮生物容器NY1181输精细管3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1冷冻精液frozensemen经处理后在液氮中（-196℃）冷冻保存的精液。3.2冻融精液frozen-thawedsemen冷冻精液在39℃水浴解冻后的精液。3.3前进运动精子数progressivemotility每支细管冻融精液中向前运动的精子数。4质量要求4.1细管4.1.1外观应符合NY1181要求。4.1.2规格0.25ml。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—201724.1.3容量≥0.18ml。4.2冻融精液4.2.1精子活力≥30%（即0.3）。4.2.2前进运动精子数≥1000万个/管。4.2.3畸形率≤18%。4.2.4细菌菌落数≤100cfu/ml。5抽样根据每头梅花鹿冷冻精液不同的生产批次进行抽样检测，抽样方法应符合GB/T2828.11规定。6试验方法应按附录A的要求执行。7储存冷冻精液应装在包装物内，保存在液氮罐中，定期检查罐中液氮的量，并及时添加液氮以保持包装物完全浸在液氮中，液氮罐应符合GB/T5458的规定。8标识细管标识应符合附录B的规定，包装物标识清晰。9运输冷冻精液在运输过程中应保持液氮罐直立，包装物完全浸在液氮中。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—20173AA附录A（规范性附录）梅花鹿冷冻精液质量检测方法A.1解冻A.1.1器材细管镊子、恒温水浴锅。A.1.2解冻方法从液氮罐中取出细管冻精，放入到39℃的水浴锅中，完全融化即可。A.2容量A.2.1器材细管剪、细管推针、1.0ml量筒。A.2.2方法解冻方法见A.1.2，用细管剪剪去封口端，用细管推针将精液全部注入到1.0ml量筒内，读数即为每支细管冷冻精液容量。A.2.3计算如所检冻精为1支，则读数即为容量；如检测支数n≥2，按公式（A.1）计算：nQQQQn21.................................(A.1)式中：Q——细管冻融精液容量，单位为ml；1Q——第一支细管中精液容量，单位为ml；2Q——第二支细管中精液容量，单位为ml；nQ——第n支细管中精液容量，单位为ml；n——检测冷冻精液支数。A.3精液质量检测A.3.1精子活力本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—20174A.3.1.1器材显微镜、精子动力分析系统、载玻片、盖玻片、移液器、枪头、小试管、试管架。A.3.1.2方法解冻方法见A.1.2，用移液器取充分混匀后的解冻精液(或A.2.1检测后的样品）7µl～10µl置于预热好的载玻片上，盖上盖玻片后，立即在显微镜下观察（10×或40×物镜）精子活力，也可使用精子动力分析系统观察活力，分别观察三个视野进行全面评定。A.3.1.3计算三个视野活力观察值的平均值按公式（A.2）计算：3321nnnM..................................(A.2)式中：M——精子活力，%；1n——第一视野精子活力，%；2n——第二视野精子活力，%；3n——第三视野精子活力，%。A.3.2前进运动精子数A.3.2.1器材血细胞计数板、血色素管、显微镜或精子动力分析系统、计数器、小试管、试管架、血盖片、移液器、枪头、1.0ml吸管、3%氯化钠溶液。A.3.2.2方法解冻方法见A.1.2，解冻后精液充分混匀后用血色素管或移液器吸取0.02ml(或A.2.1检测后的样品），缓慢注入到盛有0.98ml的3%氯化钠溶液的试管内，充分混匀，配制成稀释50倍的精液。用吸管吸取稀释后精液置于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满整个计数室，不允许有气泡，然后在显微镜下或精子动力分析系统中观察计数。A.3.2.3计算a)每支细管冻融精液精子数=5个方格中精子数×5（计数室内25个中方格中精子数）×10（1mm3内精子数）×1000（每毫升精子数）×50（稀释倍数）×容量即为每支细管冻融精液精子数=5个方格中精子数×250万（细管）×容量b)每样品观察相邻两个计数室，取平均值；如两个计数室计数结果误差超过5%，则应重新检测。c)每支细管冻融精液中前进运动精子数按式（A.3）计算：Msc.....................................(A.3)式中：c——每支细管冻融精液前进运动精子数，单位为个；s——每支细管冻融精液精子数，单位为个；M——活力，%。A.3.3精子畸形率本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—20175A.3.3.1器材显微镜、天平、pH计、量筒、病理级载玻片、盖玻片、血球分类计数器、移液器、枪头、胶头滴管、双蒸水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、碳酸镁、甲醇、甲醛、甘油、棕色试剂瓶。A.3.3.2试剂配制a)碳酸镁中和甲醛溶液甲醛（40%）500mlMgCO38.0g完全溶解过滤后密闭保存于棕色试剂瓶中备用。b)福尔马林磷酸盐固定液NaH2PO4·2H2O0.55gNa2HPO4·12H2O2.25g40%甲醛溶液（经MgCO3中和）8.0ml加0.89%NaCl溶液30ml，待磷酸盐充分溶解，用0.89%NaCl溶液定容100ml，静置24小时，备用。c)磷酸缓冲液：NaH2PO4·2H2O0.55gNa2HPO4·12H2O2.25g溶于双蒸水，定容至100ml。d)姬姆萨原液：姬姆萨染料1.0g甘油66.0ml甲醇66.0ml称取姬姆萨染料，溶于少量甘油，于研钵内研磨至无颗粒，再将全部甘油倒入，置于56℃恒温箱中2小时，然后加入甲醇，过滤后密闭保存于棕色试剂瓶中备用。e)姬姆萨染液姬姆萨原液、磷酸缓冲液、双蒸水按体积比2:3:5的比例混合均匀，根据需要量、现用现配。A.3.3.3方法精液解冻方法见A.1.2，或使用精子活力检测的样品。a)抹片：取10µL混匀后精液，滴于载玻片右端，取另一洁净、边缘平滑的载玻片以45°角从左侧接触精液滴，让精液沿着盖玻片底部扩散，然后由右向左推动载玻片使精液均匀涂抹在载玻片上，载玻片标号，每个样品制作三个抹片。b)风干、固定：将制备好的抹片在自然条件下水平放置风干5min～20min。将风干抹片放平，用胶头滴管取1.0ml～2.0ml福尔马林磷酸盐缓冲固定液缓慢滴在涂片上，固定15min。c)水洗、染色：倒掉固定液，在蒸馏水中冲洗，自然风干。将涂片水平放置，用移液器取2.0ml事先配制好的姬姆萨染液滴在涂片上，避免产生气泡，染色3小时。d)水洗、镜检：倒掉染色液，在蒸馏水中冲洗干净，自然风干后封片。用40～60×物镜进行观察，每次观察200个精子，计数畸形的精子数量，取三个样片平均值，三个样片间差异不能超过5%，如超过应重新制片。e)精子畸形率按式（A.4）计算：本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—201761001SAA..................................(A.4)式中：A——精子畸形率，%；1A——畸形精子数，单位为个；S——精子总数，单位为个。A.4菌落数检测A.4.1器材培养箱、超净工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、天平、称量匙、高压灭菌锅、微波炉、培养皿、水浴箱、pH计、牛皮纸、橡皮筋、记号笔、放大镜、酵母提取物、胰化蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1mol/L盐酸、1mol/L氢氧化钠，双蒸水。A.4.2培养基制作酵母提取物5.0g胰化蛋白胨10.0g氯化钠10.0g用双蒸水溶解后加琼脂粉15.0g，微波炉加热溶解，调节pH至7.4～7.6，分装于三角烧瓶中用牛皮纸密封后高压灭菌，待温度下降后在超净工作台内将培养基倒入培养皿内，静置使其凝固后，根据实际情况标注编号。A.4.3方法在超净工作台内按照无菌步骤操作，用移液器吸取解冻混匀后的精液20µl，加注到培养皿内培养基表面后，用接种针涂抹均匀后，静置十分钟后，与对照培养皿同时倒置放入37℃培养箱内，培养48小时。每支精液涂三个平皿，培养后分别计数，计数时应将平板面对亮光，用记号笔在观察到菌落处做标记，并用计数器计数、防止遗漏，必要时使用放大镜观察，菌落计数结果采用三个平皿的平均值。A.4.4计算每支细管冻融精液的细菌菌落数按式（A.5）计算：02.03321QnnnB..............................(A.5)式中：B——细菌菌落数，单位为cfu/ml；1n——第一平皿中菌落数，单位为cfu/ml；2n——第二平皿中菌落数，单位为cfu/ml；3n——第三平皿中菌落数，单位为cfu/ml；Q——每剂冻精容量，单位为ml。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2611—20177BB附录B（规范性附录）梅花鹿细管冷冻精液标记方法B.1梅花鹿细管冷冻精液标记方法梅花鹿细管冷冻精液标识由四部分组成，排列顺序如下：a)第一部分：种鹿所属单位。b)第二部分：品种。c)第三部分：生产日期。d)第四部分：种鹿号。第一、第二部分用汉语拼音大写首字母表示所属单位名称和梅花鹿品种，第三部分冻精生产日期由六位数按年月日顺序排列，年月日各占二位数，年度的后两位数组成年份的二位数，月日不够二位的，月日前分别加“0”补充为二位数。第四部分种鹿号取该鹿号码的后五位数。部分之间空一个汉字（二个字节），标记的字迹必须清晰且易于辨认。示例：棉塞封口端TCSJL15091800008封口端TCS为中国农业科学院特产研究所代号，JL为吉林梅花鹿品种代号，150918为2015年9月18日的生产日期代号，00008为公鹿号。_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印