DB32∕T 3209-2017 脱毒甘薯种薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV检测技术规程

ICS65.020.20B23DB32江苏省地方标准DB32/T3209—2017脱毒甘薯种薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV检测技术规程TechnicalrefulationforSPCSV、SPVG、SPLCVdetectionofvirus-freeseed(seedling)sweetpotatoes2017-05-05发布2017-06-05实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T3209—2017I前言本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编制。本标准由江苏徐州甘薯研究中心提出。本标准主要起草单位：江苏徐州甘薯研究中心。本标准主要起草人：谢逸萍、孙厚俊、张梅、杨冬静、张成玲、赵永强、徐振，谢睿寰，孙扬。DB32/T3209—20171脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程1范围本标准规定了脱毒甘薯种薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV检测的术语和定义、抽样方法、检测方法和判定指标。本标准适用于脱毒甘薯种薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4406种薯NY/T1200甘薯脱毒种薯NY/T402-2000脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用本标准。3.1脱毒组培苗virus-freetissuecultureseedling应用茎尖组织培养技术获得，经检测，确认不含特定病毒的甘薯再生组培苗。3.2扩繁苗propagationseedling将脱毒组培苗切段快速繁殖获得的试管苗。3.3脱毒种薯(苗)virus-freeseedtuberorseedling从脱毒苗繁殖开始，经逐代繁殖体系获得的不携带特定病毒的种薯（苗）。分原原种、原种、良种三个级别。3.4原原种pre-elite用脱毒试管苗在60目防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。DB32/T3209—201723.5原种elite用原原种作种薯，在防虫网室、温室隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。3.6良种excellentseedorseedling用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。3.7病毒病株允许率Maximumvirus-infectedplantpercentageallowed指各级甘薯种薯(苗)繁殖田中病毒病株的允许比率。4检测病毒种类甘薯褪绿矮化病毒（Sweetpotatochloroticstuntvirus，SPCSV）甘薯G病毒（SweetpotatovirusG，SPVG）甘薯卷叶病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV）5抽样5.1组培苗抽样5.1.1脱毒组培苗每株必须检测。5.1.2扩繁苗随机抽取l%～2%检测。5.2田间抽样5.2.1原原种田和原种田抽样定植后30d、60d、收获前2周，采用5点随机取样法，抽样数量为0.1hm2以下200株；0.11hm2～1hm2500株；超出1hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取上、中、下部叶片和叶柄1g～5g，4℃~6℃保湿存放，24h内检测。5.2.2良种田抽样定植后30d、收获前两周，采用随机取样法，0.1hm2以下检验5点，每点40株；0.11hm2～1hm2检验5点，每点100株；1.1hm2～5hm2检验10点，每点100株；超出5hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。取样方法及样品保存同5.2.1。5.3种薯(苗)抽样DB32/T3209—20173种薯送检数量应不低于100kg,种苗送检数量应不低于100株。6检测方法6.1溶液配制所用化学试剂为分析纯级规格，用水为灭菌蒸馏水。6.1.1三羟甲基氨基甲烷溶液(TBS)(pH=7.5)三羟甲基氨基甲烷（Tris）4.84g，氯化钠（NaCl）58.44g，溶于1990ml蒸馏水中，用18.5％盐酸（HCl）调pH至7.5，定容至2000ml。6.1.2洗涤缓冲液(T-TBS)1.0ml吐温-20(Tween-20)溶于2000mlTBS中。6.1.3提取缓冲液亚硫酸钠（Na2SO3)1.0g，溶于TBS中，定容至500ml。6.1.4封闭缓冲液(现用现配)2％脱脂奶粉6.0g，先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至300ml，混匀。加6ml曲拉通（Triton）X-100充分混匀。6.1.5抗体稀释缓冲液2％脱脂奶粉6.0g，先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至300ml，混匀。6.1.6底物缓冲液(pH=9.5)三羟甲基氨基甲烷（Tris）6.05g，氯化钠(NaCl)2.92g，氯化镁(MgCl2·6H2O)0.51g，溶于450ml蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容至500ml,6.1.7氯化硝基四氮唑蓝（NBT）储备液氯化硝基四氮唑蓝（NBT）0.04g溶于1.2ml70%N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20℃避光保存备用。6.1.85-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）储备液0.02g5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)溶于1.2mlN，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20℃避光保存备用。6.1.9底物溶液(现用现配)将75µlNBT储备液溶于25ml底物缓冲液中，再逐滴加入75µlBCIP储备液，边加边振摇混匀。6.2样品制备从田间取回待测脱毒甘薯样品（取叶片加叶柄）放入事先编号封口袋，用直径15mm打孔器取叶片和叶柄的结合部，需隔在塑料袋外取，只留叶片和叶柄的结合部，其余除去；加1ml提取缓冲液，充分研DB32/T3209—20174磨。4℃静置30min～40min，或室温放置20min～30min，使植物汁液充分提取；取澄清汁液点样。样品为块根时催芽处理后取幼芽、叶制样。6.3操作步骤6.3.1点样将一张干燥的滤纸放在实验台上，将硝酸纤维素膜放在上面，避免气泡产生；b、用移液枪吸取塑料袋中提取液上清部分15µl～20µl，点在膜上方格正中，枪头不可触碰到膜，一个样品用一个枪头，在每张膜的最后设置阳性、阴性和空白对照，点样完成将膜转到一张干燥的滤纸上，干燥15min～20min，在继续实验前可以用两张滤纸夹着膜保存。点样过程中一直戴手套和用镊子接触膜，手指印可能造成假阳性结果。6.3.2封闭将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中，室温下摇床振荡(50rpm/min)1h。6.3.3孵育第一抗体将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡(50rpm/min)过夜。6.3.4洗涤用洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡(100rpm/min)3min。6.3.5孵育第二抗体将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡(50rpm/min)1h。6.3.6洗涤洗涤4次，方法同6.3.4。6.3.7显色将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室温下摇床振荡(50rpm/min)孵育30min。6.3.8终止反应弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡(100rpm/min)3min。6.3.9阳性判断晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。7判定指标凡硝酸纤维素膜酶联免疫吸附检测呈阳性者为带毒薯(苗)。原原种：病毒病株允许率是0。原种：病毒病株允许率≤2.0%。良种：病毒病株允许率≤10%。_________________________________