DB43∕T 1203-2016 饲料中雌二醇、炔雌醇、乙烯雌酚的测定 高效液相色谱法

湖南省地方标准DB43饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定高效液相色谱法DeterminationofEstradiolandEthinylestradiolandDiethylstilbestrolinfeedsHighperformanceliquidchromatographicmethodDB43/T1203—2016湖南省质量技术监督局发布2017-02-13实施2016-12-13发布ICS65.120B46DB43/T1203—2016I目次前言………………………………………………………………………………………………………Ⅱ1范围……………………………………………………………………………………………………12规范性引用文件………………………………………………………………………………………13原理……………………………………………………………………………………………………14试剂与材料……………………………………………………………………………………………15仪器与设备……………………………………………………………………………………………26采样与试样的制备……………………………………………………………………………………27测定步骤………………………………………………………………………………………………28结果计算………………………………………………………………………………………………39灵敏度、准确度和精密度………………………………………………………………………3附录A（资料性附录）雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图………………………………4DB43/T1203—2016II前言本标准按GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。本标准起草单位：湖南省兽药饲料监察所。本标准主要起草人：隆雪明、欧阳龙、陈福华、杨彦宁、周灿、易建希、李裕、陈启友、谭美英、黄勇、肖安东。DB43/T1203—20161饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中雌二醇（Estradiol）、炔雌醇（Ethinylestradiol）、己烯雌酚（Diethylstilbestrol）的高效液相色谱测定方法。本标准适用于我省配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3原理采用甲醇提取试样中的雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚，固相萃取柱净化，收集流出液，高效液相色谱法测定，外标法定量。4试剂与材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的规定。4.1甲醇，色谱纯。4.2乙腈，色谱纯。4.3甲醇。4.4雌二醇标准品，纯度≥96.0%。4.5炔雌醇标准品，纯度≥99.0%。4.6己烯雌酚标准品，纯度≥99.0%。4.7标准储备液：分别准确称取雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准品25mg（精确到0.01mg）于25mL容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，即为1.00mg/mL标准储备液。-18℃以下避光保存，有效期1年。4.8标准工作液：移取适量标准储备液，用色谱纯甲醇稀释成浓度为(0.5～50)µg/mL的标准工作液，现配现用。4.9中性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL，或相当者。4.10微孔滤膜：0.22μm，有机膜。DB43/T1203—201625仪器与设备5.1高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。5.2分析天平：感量0.00001g和0.001g。5.3离心机：转速≥10000r/min，带有50mL离心管。5.4超声波清洗机。6采样与试样的制备6.1采样按GB/T14699.1的规定执行。6.2试样制备按GB/T20195的规定执行。7测定步骤7.1提取称取试样2g（精确到0.001g）,置于50mL离心管中,准确加入20mL甲醇，涡旋振摇1min,室温下超声提取5min，涡旋30秒后静置分层，于50mL离心管中10000r/min离心5min，取上清液供固相萃取柱净化。7.2净化将固相萃取柱用3mL甲醇活化，移取适量上清液过柱，弃除前4mL流出液，收集1mL流出液，涡旋混匀，微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱分析。7.3测定7.3.1高效液相色谱参数色谱柱：C18柱（250mm×4.6mm，5μm），或相当者。流动相：乙腈+水（V+V=50+50）。流速：1.0mL/min。进样量：20μL。检测波长：205nm。7.3.2试样测定取试样溶液和相应的标准工作液进样，以组分的保留时间定性，以色谱峰面积积分值做单点或多点校准，外标法定量。标准工作液和试样溶液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的响应值均应在仪器检测的线性范围内。雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图参见附录A，雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准工作液色谱图参见附录A中图A1，饲料中添加雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准物质色谱图参见附录A中图A2。7.3.3空白试验除不加试料外，采用上述相同步骤操作。DB43/T1203—201638结果计算试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得：SSCAVXAm××=×X——试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——试样中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的峰面积；Cs——标准工作液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；As——标准工作液中雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚的峰面积；V——提取用溶液的总体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）；计算结果需扣除空白试样值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示。测定结果保留三位有效数字。9灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚在饲料中的定量限为5mg/kg。9.2准确度本方法雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚在5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg添加浓度水平上的回收率范围为（70～120）%。9.3精密度本方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。DB43/T1203—20164附录A(资料性附录）雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚高效液相色谱图0.02.55.07.510.012.515.017.5min0102030405060mV检测器ACh1:205nm图A1雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准工作液色谱图（5µg/mL）0.02.55.07.510.012.515.017.5min01020304050607080mV检测器ACh1:205nm图A2饲料中添加雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚标准物质的色谱图（50mg/kg）