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ICS01.040.67B50/59DB21辽宁省地方标准DB21/T2628—2016鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片分析法theidentificationoffishspecies—themethodofPCR-RFLPcombinedwithgenechip2016-05-09发布2016-07-09实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2628—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部分标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位:大连出入境检验检疫局。本标准主要起草人:闫平平、齐欣、田卓、崔妍、徐文英、刘莹、曲世超、尚宝玉、陈溪、黄大亮。本标准系首次发布的地方标准。DB21/T2628—20161鱼类物种鉴定PCR-RFLP结合基因芯片分析法1范围本标准规定了远洋捕捞鱼类和沿海地区经济鱼类物种鉴定方法PCR-RFLP结合基因芯片分析法的技术规范要求。本标准适用于鱼体肌肉组织,鱼糜及其鱼制品中鱼基因组的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1物种物种是生物分类学的基本单位,也是生物繁殖的基本单元。物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体,与其他相似群体在生殖上相互隔离,并在自然界占据一定的生态位。3.2PCR-RFLPpolymerasechainreactionrestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性聚合酶链式反应3.3基因芯片基因芯片也叫DNA芯片、DNA微振列、寡核苷酸阵列。基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。4抽样与制样将实验室样品粉碎,充分混匀后待用。5防污染措施PCR检验过程的防污染措施应符合GB/T27403的规定6原理DB21/T2628—20162RFLP是根据不同品种基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点直接发生了碱基的直接插入、缺失,导致酶切片段大小发生变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种的DNA水平的差异,多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。PCR-RFLP的基本原理是PCR扩增目的DNA扩增产物在有特异性内切酶消化切割成不同大小片段,直接在基因芯片分析仪上分辨,不同等位基因的限制性酶切位点分布不同,产生不同程度的DNA片段条带。7仪器设备7.1电子天平:感量0.001g7.2台式离心机(最高转速15000g),台式小型离心机7.3双温水浴锅(37℃±1、65℃±1)7.4漩涡振荡器7.5低温冰箱(2℃-8℃)、冷藏冷冻冰箱(-20℃)7.6荧光PCR仪;7.7高压灭菌锅7.8实时荧光PCR仪7.9芯片电泳仪(2100生物分析仪)。7.10微量可调移液器及配套吸头8主要试剂除另有规定外,所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和Dnase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025的规定。8.1DNA提取试剂盒8.2PCR-RFLP鱼种鉴定试剂盒(包括PCR扩增试剂盒和限制性内切酶酶切试剂盒),试剂盒内包括细胞色素b基因特异性片段扩增用2×PCRMasterMix、PrimerMix、dH2O、限制性内切酶DdeI、HaeIII、NlaIII及Buffer等。8.3DNA1000芯片试剂盒;8.4其他PCR相关制品均购自生物公司。9检测步骤9.1样品预处理DB21/T2628—20163剪取样品50~100mg大小的组织,混合均匀后捣碎后放入1.5mL微量离心管(Eppendorf)中待用。9.2基因组DNA提取待用样品加入20μL蛋白水解酶K和200μL蛋白裂解缓冲液,混匀后65℃孵育10min,14000g离心3min,取上清液,按照DNA提取试剂盒说明提取鱼基因组。最后将鱼基因组DNA溶于30μL去离子水中(DNA的质量浓度不低于005mg/L),于-20℃保存。可根据实际情况选择适宜的方法,对于一种动物可以提供几种常用的DNA提取方法,应允许其他提取方法的使用,提取的DNA应满足稳定获得PCR扩增产物要求。9.3目标DNA片段的PCR反应体系PCR反应体系见表1,每个样品各做二个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全落入反应液中,不要粘附于管壁上。在25μL总体系中进行,其中包括模板DNA1μL。表1PCR反应体9.4分析条件PCR反应条件按如下表2程序进行,预期扩增片段大小约为464bp。表2PCR反应参数SegmentNumberofCyclesTemperatureDuration1195℃5minutes95℃30seconds50℃30sconds24072℃30seconds3172℃7minutes注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整9.5限制性内切酶酶切:将25μLPCR产物分别与等量的Dde、Hae和Nla3种限制性内切酶混匀,37℃酶切2h,然后加入1μL60mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),混匀,65℃灭活内切酶15min。ComponentVolume(1Reaction)Volume(5Reaction)dH2O,sterile9μL45μL2×PCRMasterMix12.5μL62.5μLPrimerMix2.5μL12.5μLDB21/T2628—201649.6RFLP分析:DNA凝胶(gel)和DNA浓缩染料(dye)在室温下静置30min,按试剂盒说明将DNA凝胶与浓缩染料混匀(geldye),2240g离心15min。依次在芯片相应孔中加入9μL预染胶(geldye)、5μL阳性对照(marker)、1μLDNA相对分子质量标准物(ladder)和1μL样品(酶切产物)。在Agilent2100芯片生物分析仪上分析酶切产物。9.7精密度试验在重复条件下,获得多次试验结果的相对偏差即酶切数据大小不得超过产物大小的5%。10结果处理与分析对于PCR产物的RFLP酶切结果进行分析,选取的DdeI、HaeIII和NlaIII酶的酶切结果表现方式分为两种,图谱分析和数据分析。图谱可以显示出不同的条带,数据分析显示出酶切数据大小,进而对鱼种进行区分。11结果判断与表述11.1限制性内切酶酶切结果样品PCR产物采用内切酶DdeI、HaeIII和NlaIII酶切后,酶切片段与附录A中不同鱼种酶切片段进行比较。11.2结果表述PCR扩增产物酶切比对结果为××鱼种。DB21/T2628—20165AA附录A(资料性附录)酶切片段比对鱼种名DdeⅠ酶HaeⅢ酶NlaⅢ酶真鳕2092474710933194104286狭鳕20924074105248103287黑线鳕4504543598189马哈鱼11935443899192无须鳕466110330129360小黄鱼4411263368898286花鲈88115261141315438蓝点马鲅213226127146183121159180鲐鱼21122412732689103274棘头梅童鱼44613033091103285许氏平鮋146295134323103362长蛇鲻4754410632284105303鲬鱼16227914428998190日本下鱵鱼12334914918994107289长吻红舌鳎145324131330448斑纹条鳎165279135290473方式云鳚122266148326146283太平洋绒杜父鱼456148330148285黄尾鰤123264436127164191绿鳍马面鲀123295180232151319大菱鲆123295135150189488日本笠鳚1233508597179104288牙鲆14524096135103373大泷六线鱼45492150238103376斑尾复鰕虎鱼48710732294122164石鲽14628313723892106295木叶鲽18924313415991107206粗壮拟庸鲽14626713729493106290黄盖鲽122332108127192125350亚洲箭齿鲽96148217133344108378星斑川鲽18727713529392105289DB21/T2628—20166鱼种名DdeⅠ酶HaeⅢ酶NlaⅢ酶马舌鲽4838629492105293箭齿鲽鱼96148216133342108378平头鲽鱼14626913729491105290黄金鲽鱼160285135296184292岩鲽19029013529394107294黄肚鲽鱼14530513829492106197庸鲽鱼4838629492105293高眼鲽15727413129087101290钝吻黄盖鲽15630542790104287_________________________________
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