DB21∕T 2631-2016 真鲷虹彩病毒LAMP 检测方法

ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T2631—2016真鲷虹彩病毒LAMP检测方法Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforRedseabreamiridoviralvirus2016-05-09发布2016-07-09实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2631—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：肇慧君，胡强，刘钊，张达古拉，栾慎顺，张雪。DB21/T2631—20161真鲷虹彩病毒LAMP检测方法1范围本标准规定了真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridoviralvirus，RSIV）的环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。本标准适用于RSIV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3符号代号和缩略语下列缩略语适用于本文件。LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）Betaine：甜菜碱Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]dNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）4试剂、仪器和耗材4.1试剂4.1.1引物选取特异性的RSIVDPO基因序列，设计出能专一性鉴别真鲷虹彩病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：外引物1（F3）：5′-AGATGCACTGCTCAAACTCG-3′外引物2（B3）：5′-CTGATTGAGAAAGCCGCTCA-3′内引物1（FIP）：5′-CCGCGCATCACTCGATGAACTGCGCTCAAAGAAGGCCGAC-3′内引物2（BIP）：5′-CGTGGCCCAGCTGTATGTAGC-TCTCCTCAAGACGGTGGTG-3′4.1.2商品化DNALAMP法扩增试剂盒。其中：BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。DB21/T2631—201622×反应缓冲液（RM）：含40mMTris-HCL（pH8.8）、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine（甜菜碱）、2.8mMdNTPs每种。4.1.3荧光目视染料。4.2仪器与耗材4.2.1Loopamp浊度仪：日本荣研化学株式会，型号LA-320C。4.2.2组织研磨器。4.2.3普通冰箱和超低温冰箱。4.2.4反应管：由朗报loopamp提供。4.2.5移液器：量程0.5μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL～1000μL。4.2.6吸头，配套移液器待用。5生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T2123-2008的有关规定。6操作步骤6.1样本的采集与处理6.1.1采样按GB/T18088的标准采集样品。体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长大于4cm的鱼取脾和肾。6.1.2样品处理从病鱼的脾和肾组织采集的样品，按照重量体积1:10的比例，加入0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.2)，用组织研磨器制备组织匀浆，备用。6.2RSIV的LAMP检测6.2.1核酸提取DNA核酸提取可使用市售商品化的DNA抽提试剂盒对组织匀浆液进行抽提。6.2.2LAMP反应体系LAMP扩增反应采用脱氧核糖核酸扩增试剂盒（LAMP法），具体操作步骤参照试剂盒说明书。RSIVLAMP反应体系见下表。表1RSIVLAMP样品反应体系(25μL)组分工作液浓度加样量/μL2×反应缓冲液（RM）2×12.5外侧上游引物（F3）5μmol/L1外侧下游引物（B3）5μmol/L1内侧上游引物（FIP）40μmol/L1DB21/T2631—20163内侧下游引物（BIP）40μmol/L1BstDNApolymerase8U/μL1DNA模板－5荧光目视染料－1去离子水－1.5表2RSIVLAMP对照反应体系(25μL)组分工作液浓度加样量/μL2×反应缓冲液（RM）2×12.5引物溶液DNA（PMDNA）－2.5BstDNApolymerase8U/μL1阳性对照DNA（PCDNA）/阴性对照－2荧光目视染料－1去离子水－66.2.3LAMP反应过程按照表1、表2所述配制反应体系：62℃恒温扩增60min，80℃5min使酶失活，反应即结束。6.2.4对照反应设置每次反应设置的阳性对照、阴性对照参照LAMP扩增反应采用脱氧核糖核酸扩增试剂盒进行。7结果判定可通过以下两种方式任何一种进行判定：a）通过浊度仪检测浊度变化判读结果：在LAMP浊度仪检测图中，随着反应产物浊度的增加，模块颜色转变为红色，表明RSIV基因被扩增，判定为阳性；而反应液未发生扩增时浊度无变化（近于0），模块的颜色仍旧为绿色，表明不存在RSIV基因的扩增，判定为阴性。b）通过观察荧光颜色变化判读结果：反应结束后，观察反应管的颜色变化，反应液显示绿色荧光的判为阳性，而反应液显示浅橙色荧光的判为阴性。DB21/T2631—20164AA附录A（规范性附录）试剂的配制以下所用试剂均为分析纯。A.10.01mol/LPBS氯化钠（NaCL，分析纯）8.0g氯化钾（KCL，分析纯）0.2g磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）0.2g磷酸氢二钠（Na2HPO4..12H2O，分析纯）3.0g双蒸水1000mL过滤除菌后分装备用。_________________________________