DB22T 2565-2016 流感病毒分离MDCK细胞法

ICS07.100C04备案号：54242-2017DB22吉林省地方标准DB22/T2565—2016流感病毒分离MDCK细胞法TheisolationandculturemethodforInfluenzavirusinMDCKcell2016-12-09发布2017-03-01实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—2016I前言本标准根据GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：李静、柳鸿敏、吴东林、臧希卉。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—20161流感病毒分离MDCK细胞法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了无血清流感病毒分离MDCK细胞法。本标准适用于无血清流感病毒分离。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求3生物安全级别和生物安全要求3.1生物安全级别生物安全二级。3.2生物安全要求实验人员应穿戴医用防护服、防护鞋、医用防护口罩、工作帽、医用乳胶手套。4试剂和材料4.1无血清MDCK细胞培养液4.2流感病毒分离无血清培养液4.3青、链霉素母液：含10000U/mL青霉素G和10000µg/mL硫酸链霉素4.4EDTA-胰酶：胰酶浓度为0.25%，EDTA·4Na浓度为0.53mmol/L4.5TPCK-胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）：2mg/mL4.6磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01mol/L，pH值为7.24.7Hank’s液：pH值为7.2～7.44.8病毒采样液：内带拭子4.9T-25细胞培养瓶4.10无菌移液管：1mL、10mL4.11无菌离心管：1mL、10mL4.12乙醇溶液：70%～75%乙醇本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—201625仪器设备5.1生物安全柜：CLASSⅡ型5.2倒置显微镜5.3CO2恒温培养箱：35℃±1℃和37℃±1℃5.4水浴箱：37℃±1℃5.5冰箱：4℃5.6低温冰箱：-70℃5.7漩涡振荡器5.8高压灭菌器5.9台式离心机6标本6.1标本的采集6.1.1鼻拭子将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻颚处，旋转后静止待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。将拭子头浸入病毒采样液（4.8）中，弃去拭子尾部后送检。6.1.2咽拭子用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧扁桃体及咽后壁后，将拭子浸入病毒采样液（4.8）中，弃去拭子尾部后送检。6.2标本的运送和保存新鲜采集的标本应在0℃～4℃条件下48h内运送至实验室。未能48h内送至实验室的，应置低温冰箱（5.6）中保存。6.3标本处理用漩涡振荡器（5.7）将标本振荡混匀置4℃冰箱（5.5）内待其自然沉淀10min后，取900µL标本加入含有100µL青、链霉素母液（4.3）的1mL无菌离心管（4.10）中，置于4℃冰箱（5.5）内过夜。7试验步骤7.1准备试剂7.1.1无血清MDCK细胞生长液500mL无血清MDCK细胞培养液（4.1）加入5mL的青、链霉素母液（4.3）。7.1.2流感病毒生长液500mL流感病毒分离无血清培养液（4.2）加入5mL的青、链霉素母液（4.3）以及0.5mLTPCK-胰酶（4.5），使TPCK-胰酶终浓度为2µg/mL。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—201637.2MDCK细胞的培养7.2.1将配好的无血清MDCK细胞生长液（7.1.1）、EDTA-胰酶（4.4）和PBS（4.6）置37℃水浴预热15min，瓶体外用70%～75%乙醇擦拭后放于生物安全柜内。7.2.2选择80%～90%生长融合的MDCK细胞，弃去细胞培养瓶中的培养液，用10mL无菌移液管吸取6mLPBS清洗细胞三次。7.2.3加入1mL37℃预热的EDTA-胰酶，轻轻地晃动细胞瓶，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。7.2.4将细胞瓶置于37℃，5%CO2恒温培养箱内孵育（约5min～10min），至细胞收缩变圆从细胞瓶内壁分离。7.2.5加5mL无血清MDCK细胞生长液（7.1.1）终止消化，用无菌移液管将细胞团轻轻吹散。7.2.6细胞悬液转入离心管中，800rpm离心5min，去除上清液，重新加入无血清MDCK细胞生长液（7.1.1）悬起细胞（细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞）。7.2.7每个T-25细胞培养瓶中加6mL（6×105/mL细胞）细胞悬液，置于37℃5%CO2恒温培养箱中，每天观察细胞状态。2～3日可长成80%～90%融合的单层细胞。7.3流感病毒MDCK细胞分离7.3.1将配好的流感病毒生长液（7.1.2）和Hank’s（4.7）液置37℃水浴预热15min后，瓶体外用70%～75%乙醇擦拭后放于生物安全柜内。7.3.2倒置显微镜40倍物镜观察，选择75%～90%生长融合的处于对数生长期的MDCK细胞用于流感病毒的分离培养。7.3.3轻轻倒出细胞生长液，用10mL无菌移液管吸取6mLHank’s清洗MDCK细胞，反复3次。7.3.4吸取200µL处理过的标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。7.3.5将培养瓶放入35℃，5%CO2恒温培养箱中孵育1～2h。7.3.6吸出接种液体，用6mLHank’s清洗细胞，反复2次，然后加入6mL流感病毒生长液于细胞培养瓶中。7.3.7放置于35℃，5%CO2恒温培养箱中，每日观察细胞病变情况。7.4细胞培养物的收获当75%～100%细胞出现病变（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）时进行收获。即使无细胞病变也应该于第7天收获。8质量保证和控制8.1MDCK细胞系的敏感性检测在过量传代的情况下，MDCK细胞可能会失去其对流感病毒的敏感性。实验室应在液氮中保存低代数的细胞株。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传代15～20代，或细胞达到40代以上时，需进行敏感性测定。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。8.2设置阴阳性对照选择已知的流感病毒阳性毒株或阳性标本作为阳性对照，选择阴性标本或者磷酸盐缓冲液作为阴性对照。本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2565—201649菌（毒）种的保存及管理分离得到的流感病毒毒株，应置于菌（毒）种库中-70℃或以下条件保存。应实行双人双锁管理，做好相关菌（毒）种保存和使用登记。10结果判读进行红细胞凝集试验（HA），HA≥8时用红细胞凝集抑制试验（HI）方法进行流感病毒的鉴定。如没有红细胞凝集现象，应继续盲传1次～2次。HA试验仍为阴性者，认为MDCK细胞病毒分离阴性。对于HA＜8的细胞分离物继续进行细胞传代，直至HA≥8时才能利用HI方法进行流感病毒的鉴定。经连续传代2次以上，HA＜8者，可以用流感病毒核酸检测方法鉴定分型。11废弃物处理及防治污染的措施11.1检测过程中的废弃物经121℃高压灭菌30min后再弃置。11.2废弃物处置应按照GB19489-2008中7.19项的有关规定执行。11.3为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员进行废弃物处理。_________________________________本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印