DBS13 004-2016 食品安全地方标准 创伤弧菌检验

2016-11-28发布2017-01-01实施DBS13河北省地方标准DBS13/004—2016食品安全地方标准创伤弧菌检验河北省卫生和计划生育委员会发布DBS13/004—20162前言本标准按照GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2016年11月28日首次发布。ⅠDBS13/004—20161食品安全地方标准创伤弧菌检验1范围本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibriovulnificus）的检验方法。本标准适用于水产品中创伤弧菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃、39.5℃±0.5℃；2.2冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃；2.3恒温水浴箱：45℃±1℃；2.4均质器或无菌乳钵；2.5天平：感量0.1g；2.6无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；2.8无菌锥形瓶：容量250mL、500mL、1000mL；2.9无菌培养皿：直径90mm；2.10无菌手术剪、镊子等；2.11全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。3.2改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂：见附录A中A.2。3.3纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂：见附录A中A.3。3.43％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.4。3.53％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.5。3.6嗜盐性试验培养基：见附录A中A.6。DBS13/004—201623.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。3.10氧化酶试剂：见附录A中A.10。3.11革兰氏染色液：见附录A中A.11。3.12邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：见附录A中A.12。3.13Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.13。3.14生化鉴定试剂盒。4检验程序创伤弧菌检验程序见图１。图1创伤弧菌检验程序5操作步骤5.1样品制备生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3%氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验mCPC或CC平板样品25g（mL）+225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水挑取可疑菌落，接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂结果报告36℃±1℃，18h～24h39℃～40℃，18h～24h36℃±1℃，18h～24hDBS13/004—201635.1.1非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻。5.1.2鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液。甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。5.1.3以无菌操作取样品25g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或拍击式均质器拍击1min～2min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。5.2增菌将上述1:10样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。5.3分离5.3.1对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于mCPC或CC平板上划线分离。于39℃～40℃培养18h～24h。5.3.2典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈圆形、扁平、中心不透明边缘透明的黄色菌落，直径1mm～2mm。5.4纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18h～24h。5.5初步鉴定5.5.1氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。5.5.2涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。5.5.3挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄。5.5.4嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、3%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃±1℃培养24h，观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8％氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在3%、6%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。5.6确证鉴定取纯培养物分别接种含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24h～48h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。创伤弧菌的生化性状见表1，创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。6报告DBS13/004—20164综合以上生化试验的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出创伤弧菌。表1创伤弧菌的生化性状试验项目结果革兰氏染色镜检阴性，棒状或弧状氧化酶＋动力＋D-纤维二糖＋蔗糖－葡萄糖＋分解葡萄糖产气－乳糖＋硫化氢－赖氨酸脱羧酶＋V-P－ONPG＋注：＋表示阳性；－表示阴性。DBS13/004—20165表2创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别名称氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶V-P42℃生长蔗糖D︱纤维二糖乳糖阿拉伯糖D︱甘露糖D︱甘露醇ONPG10µgO/129150µgO/129嗜盐性试验NaCl含量（%）036810创伤弧菌V.vulnificus++-++--+-++-+V+SS-++--副溶血性弧菌V.parahaemolyticus++-++V-+-V-+++-RS-+++-溶藻弧菌V.alginolyticus++-++-+++---++-RS-++++霍乱弧菌V.cholerae++-++-V++---+++SS++---拟态弧菌V.mimicus++-++--+----+++SS++---河弧菌V.fluvialis+-+-+--V++-++++RS-++V-弗氏弧菌V.furnissii+-+-+---+--++++RS-+++-梅氏弧菌V.metschnikovii-++-+-+V+---+++SS-++V-霍利斯弧菌V.hollisae+------nd---++--ndnd-++--嗜水气单胞菌A.hydrophilia+V+-+-VV+VVV+++RR+++--类志贺邻单胞菌P.shigelloides++++---+-------SS++---注：＋表示阳性；－表示阴性；R表示耐药；S表示敏感；nd表示未试验；V表示可变。DBS13/004—20166附录A（规范性附录）培养基和试剂A.13％氯化钠碱性蛋白胨水A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLpH8.5±0.2A.1.2制法将成分（A.1.1）溶于蒸馏水中,调节pH，121℃高压灭菌10min。A.2改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂A.2.1溶液1A.2.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g氯化钠20.0g溴麝香草酚蓝0.04g甲酚红0.04g琼脂15.0g蒸馏水900.0mLpH7.6±0.2A.2.1.2制法将成分（A.2.1）溶于蒸馏水中，调节pH，加热煮沸至完全溶解。冷至48℃～55℃备用。A.2.2溶液2A.2.2.1成分纤维二糖10.0g多粘菌素B100000U多粘菌素E400000U蒸馏水100.0mLA.2.2.2制法纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，过滤除菌。将溶液2与溶液1混合，倾注平板备用。DBS13/004—20167A.3纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂A.3.1溶液1A.3.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g氯化钠20.0g溴麝香草酚蓝0.04g甲酚红0.04g琼脂15.0g蒸馏水900.0mLpH7.6±0.2A.3.1.2制法将成分（A.3.1）溶于蒸馏水中，调节pH，加热煮沸至完全溶解。冷至48℃～55℃备用。A.3.2溶液2A.3.2.1成分纤维二糖10.0g多粘菌素E400000U蒸馏水100.0mLA.3.2.2制法纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，过滤除菌。将溶液2与溶液1混合，倾注平板备用。A.43％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂A.4.1成分胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g氯化钠30.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mLpH7.3±0.2A.4.2制法将成分（A.4.1）溶于蒸馏水中，调节pH，121℃高压灭菌15min。A.53％氯化钠三糖铁琼脂DBS13/004—20168A.5.1成分蛋白胨15.0g月示蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g氯化钠30.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁（FeSO4）0.2g酚红0.024g硫代硫酸钠Na2S2O30.3g琼脂12.0g蒸馏水1000.0mLpH7.4±0.2A.5.2制法将成分（A.5.1）溶于蒸馏水中，调节pH。分装到适当容量的试管中。121℃高压灭菌15min。制成高层斜面，斜面长4cm～5cm，高层深度2cm～3cm。A.6嗜盐性试验培养基A.6.1成分胰蛋白胨10.0g氯化钠按不同量加入蒸馏水1000.0mLpH7.2±0.2A.6.2制法将成分（A.6.1）溶于蒸馏水中，调节pH，共配制5瓶，每瓶100mL。每瓶分别加入不同量的氯化钠：（1）不加;（2）3g;（3）6g;（4）8g;（5）10g。分装试管，121℃高压灭菌15min。A.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基A.7.1成分蛋白胨5.0g酵母粉3.0g葡萄糖1.0g溴甲酚紫0.02gL-赖氨酸5.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLDBS13/004—20169pH6.8±0.2A.7.2制法除赖氨酸以外的成分（A.7.1）溶于蒸馏水中，调节pH。再按0.5％的比例加入赖氨酸，对照培养基不加赖氨酸。分装小试管，每管0.5mL，121℃高压灭菌15min。A.7.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃±1℃培养不少于24h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸，故培养基仍应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡糖糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。A.83％氯化钠MR-VP培养基A.8.1成分多价蛋白胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLpH6.9±0.2A.8.2制法将成分（A.8.1）溶于蒸馏水中，调节pH，分装试管，121℃高压灭菌15min。A.93％氯化钠溶液A.9.1成分氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mLpH7.2±0.2A.9.2制法将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A.10氧化酶试剂A.10.1成分N,N,N',N',-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100.0mLA.10.2制法少量新鲜配制，于2℃～5℃冰箱内避光保存，在7d之内使用。DBS13/004—201610A.10.3试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取新鲜（24h）菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s之内呈现粉红或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色为氧化酶试验阴性。A.11革兰氏染色液A.11.1结晶紫染色液A.11.1